ثبيت آنزيم اوره‌آز روي نانو بيوفيبريل‌هاي آميلوئيدي حاصل از آلبومين سرم گاوي

Immobilization of Urease Enzyme on Amyloid Nano–biofibrils from Bovine Serum Albumin

آنزيم اوره ­آز (EC.3.5.1.5) از دسته هيدرولاز­ها است كه هيدروليز اوره را به آمونياك و دي اكسيدكربن كاتاليز مي­كند. اين آنزيم كاربردهاي مختلفي در متابوليسم نيتروژن، تهيه واكسن، كيت­هاي تشخيص اوره، صنايع نوشابه­سازي و غيره دارد. در اين تحقيق از نانورشته­ هاي آميلوئيدي حاصل از آلبومين سرم گاوي به ­عنوان بستري جديد براي تثبيت آنزيم اوره ­آز استفاده شد. توليد نانو رشته‌هاي آميلوئيدي با سه تكنيك طيف­ سنجي كنگورد، اسپكتروفلوريمتري و اسپكتروپلاريمتري بهينه­سازي شده و رشته‌هاي حاصله با تصاوير ميكروسكوپ الكتروني مورد تأييد قرار گرفتند. سپس آنزيم اوره­آز با استفاده از مولكول­ هاي گلوتارآلدهيد و با ايجاد پل­هاي عرضي روي رشته ­هاي آميلوئيدي تثبيت‌شده و فاكتورهاي سينتيكي آن با آنزيم آزاد مقايسه شدند. بيشترين ميزان توليد رشته­ هاي آميلوئيدي پس از 48 ساعت انكوباسيون آلبومين سرم گاوي با غلظت 10 ميلي­گرم بر ميلي­ليتر و دماي 70 درجه سانتي‌گراد در بافر سيترات-فسفات با pH برابر 4 به­دست آمد. آنزيم تثبيت­شده نسبت به شكل آزاد داراي قابليت نگه­داري و پايداري بيشتري بود و فعاليت ويژه بالاتر و نيز Km كوچكتري را نشان داد. دماي بهينه از 40 به 70 درجه سانتي­گراد و pH بهينه نيز از 6 تا 7 به 6 تا 9 در آنزيم تثبيت­شده بهبود يافت. بنابراين رشته‌هاي آميلوئيدي با داشتن گروه­ هاي شيميايي مختلف، براي تثبيت آنزيم اوره­آز مناسب بوده ­اند. بهبود ويژگي‌هاي سينتيكي و پايداري آنزيم اوره­آز در اثر تثبيت بر رشته­ هاي آميلوئيدي امكان استفاده گسترده ­تر از اين آنزيم را در صنايع مرتبط فراهم مي­آورد.

The urease enzyme (EC.3.5.1.5) is from hydrolase group that catalyzes urea hydrolysis to ammonia and carbon dioxide. This enzyme has various applications in nitrogen metabolism, vaccine preparation, urea diagnosis kits, drinking industries, and so on. In this study, amyloid nanofibrils from bovine serum albumin were used as a new scaffold for immobilizing the urease enzyme. The production of amyloid nano–fibers has been optimized with three techniques of Congord specrophotometry, Spectrofluorimetry and Spectropolarimetry, and the resulting fibrils have been confirmed by electron microscopy images. Then the urease enzyme was immobilized on the amyloid fibrils using glutaraldehyde molecules via cross-linked bridges and their kinetic factors were compared with the free enzyme. The highest amount of amyloid fibrils was obtained after 48 hours incubation of bovine serum albumin at a concentration of 10 mg.ml-1 and 70 ºC in a citratephosphate buffer pH 4. The immobilized enzyme had more reusability and stability than the free form and showed a higher activity and a smaller Km. Optimum temperature was improved from 40 ºC to 70 ºC and optimum pH was also improved from 6–7 to 6–9 in immobilized enzyme. In conclusion, amyloid fibrils with different chemical