استفاده از نانو رشته‌هاي آميلوئيدي به‌عنوان يك بستر پروتئيني براي تثبيت آنزيم ليپاز باكتري سودوموناس سپاسيا

Use of amyloid nano–fibrils as a protein scaffold for immobilization of lipase enzyme from Pseudomonas cepacia

آميلوئيدها در ­شرايط غيرطبيعي ­كننده از پروتئين­هاي مختلف به­ وجود مي­آيند. سطح بسيار فعال، اين مواد را به­ عنوان بستري براي تثبيت آنزيم مناسب مي­سازد. هدف از ­اين مطالعه توليد رشته­ هاي آميلوئيدي و بررسي امكان استفاده از آن­ها به ­عنوان بستر براي تثبيت آنزيم بوده است. براي توليد حداكثر ميزان آميلوئيد از روش پاسخ سطح1 استفاده شد و نتايج طيف­ سنجي كنگورد و دورنگ­نمايي دوراني2 با نرم­افزار Design Expert 7 (Trial version) تحليل شد و از ميكروسكوپ الكتروني گذاره براي تاييد حضور رشته­هاي آميلوئيدي استفاده گرديد. فرايند تثبيت با گلوتارالدهيد و با ايجاد پل­عرضي بين آنزيم و رشته­ هاي آميلوئيدي انجام شد و فاكتور­هاي سينتيكي در آنزيم آزاد و تثبيت ­شده شامل فعاليت، فعايت ويژه، دما و pH بهينه و پايداري حرارتي باهم مقايسه شدند. بيش­ترين ميزان آميلوئيد پس از 72/6 ساعت به ­هم زدن آلبومين سرم گاوي با غلظت 4/35 ميلي­گرم بر ميلي­ ليتر در بافر ميكس سيترات-فسفات با 4/49=pH و دماي 80 درجه به­دست آمد و ليپاز تثبيت­شده در فعاليت، فعاليت ويژه، Km و Vmax، دما و pH بهينه و پايداري حرارتي در دماي 40 درجه نسبت به ليپاز آزاد برتري سينتيكي نشان داد. رشته­ هاي آميلوئيدي به­عنوان موادي غني از گروه­هاي شيميايي، مي­توانند براي تثبيت آنزيم­ها مناسب باشند. اين زمينه پروتئيني مي‌تواند كانديداي مناسبي در شرايط inVivo به­عنوان بستري زيست­سازگار در تثبيت آنزيم­ها باشد. آميلوئيدها با قطر كمتر از 100 نانومتر به ­عنوان نانو مواد جديد، نه­ تنها باعث افزايش پايداري ليپاز مي­شوند، بلكه ساير خواص سينتيكي آن را به­ عنوان يك نانو-ماتريكس جديد تقويت مي‌كنند.

Amyloids are created from various proteins in denaturant conditions. Highly active surface, makes these materials suitable for enzyme immobilization. The aim of this research was to study the production of amyloid fibrils and investigate the possibility of using them as a matrix for enzyme immobilization. Response surface methodology (RSM) was used to generate the maximum amyloid content. The results of the Congored spectrometry and circular dichroism (CD) were analyzed by Design Expert 7 software (Trial version) and transmission electron microscopy was used to confirm the presence of amyloid fibrils. The immobilization was done by creating glutaraldehyde mediated crosslink of enzyme on the amyloid fibrils and kinetic factors including activity, specific activity, optimal temperature and pH and thermal stability were compared with the free enzyme. The highest amyloid content was obtained after 72.6 hours agitation of bovine serum albumin at 4.35 mg.ml-1 in mixed citrate–phosphate buffer pH=4.49 at 80 ºC and immobilized lipase was improved relative to free lipase in the case of activity, specific activity, Km and Vmax, optimal temperature and pH and thermal stability at 40 ºC. Amyloid fibrils as a rich material of chemical groups can be suitable for stabilization. This protein matrix can be a good inVivo candidate as a bio–compatible scaffold for enzyme immobilization. Amyloids with a diameter less than 100 nanometers, as new nano–materials, not only increase the stability of lipase but also enhance other kinetic properties as a new nano–matrix.