استخراج DNA از گونه هاي ماكرو جلبكي حاوي ميزان بالاي تركيبات پلي ساكاريدي و فنولي جهت مطالعات ژنتيكي

DNA Extraction from macroalgaespecies with high levels of polysaccharide and phenolic components for genetic studies

استخراج DNA خالص و كافي از ماكرو جلبك‌ها به علت دارا بودن رنج وسيعي از متابوليت­هاي ثانويه، نحوه اشتباه نمونه ­برداري و خصوصيات مرفولوژي كي آن‌ها، معمولاً مشكل است. ازآنجاكه استخراج DNA خالص جهت مطالعات مولكولي از اهميت ويژه­اي برخوردار است اين ­مطالعه باهدف استخراج آسان و ارزان DNA ژنومي باكيفيت و كميت بالا از نمونه ­هاي ماكرو جلبكي انجام شد. استخراج DNA توسط روش­هاي فنول-كلروفرم، CTAB و CTAB تغييريافته انجام شد و همچنين نيتروژن مايع جهت خرد كردن نمونه­ها حذف گرديد. درروش CTAB تغييريافته، تغييراتي در نسبت حجم بافر استخراج به نمونه، تركيبات بافر استخراج (افزايش غلظت EDTA، بتامركاپتواتانول و افزودن PVP و ساركوسيل) ايجاد شد. واكنش PCR بر اساس ژن tufA جهت اطمينان از خلوص DNA انجام شد. در ارزيابي كمي و كيفي DNA استخراجي، نسبت 280/260 نانومتر بين 1/84-1/7 و نسبت 230/260 نانومتر بيشتر از 2 نشان داده‌شده و همچنين غلظت DNA بين 8-6/5 ميكروگرم بر ميكرو ليتر اندازه­ گيري شد. محصولات PCR باندهايي را در محدوده 700-800 جفت باز در ژل آگارز نشان دادند. ارزيابي كمي و كيفي داده ­ها، خلوص و ميزان بالاي DNA استخراج‌شده به روش CTAB تغييريافته نسبت به دو روش ديگر را نشان دادند، به‌طوري‌كه نسبت­ها نشان­دهنده عاري بودن DNA از تركيبات پروتئيني و پلي­فنولي/ پلي­ساكاريدي است. ازآنجاكه آلودگي­هاي پلي­ساكاريدي و فنولي بازدارنده آنزيم­هاي واكنش PCR هستند بنابراين نتايج موفقيت‌آميز واكنش PCR نشان­دهنده خلوص DNA استخراج‌شده و كاربرد آن در مطالعات مولكولي است.DNA استخراج‌شده به روش بهينه‌شده در اين مطالعه مناسب جهت مطالعات مولكولي و نگهداري است.

Isolation of high quality and molecular weight DNA from macroalgae is usually compromised because ofexcessive contamination of secondary metabolites, disregard of the sampling conditions and their morphological properties. DNA extraction is an essential step for molecular analysis. The main objective of this study is to provide a simple and inexpensive method of isolation of pure DNA from dried blades of macroalgae.DNA extraction was performed usingCTAB, phenol-chloroform, and modified CTAB as well. Also exclude the use of liquid Nitrogen for grinding samples. The changes in our modified procedure are including: ratio of tissue to extraction buffer, optimization of extraction buffer components by increase the concentration of EDTA, b-Mercaptoethanol and adding of PVP and Sarkosyl. Also PCR reaction was performed based on tufA gene.Theratio of A260/A280 and A260/A230 (nm) were recorded between1.7 and 1.84and >2, respectively.Also the concentration of extracted DNA ranged from 6.5 to 8 mgmL-1.Clear band of PCR products were observed in agarose gel.Purity and high quantity of extracted DNA from modified CTAB method was excellent as evident by ratio result in compare with two other methods. Results also suggested that the preparations were sufficiently free of proteins and polyphenolics/polysaccharide compounds which is sufficient for molecular analysis. Polysaccharide and phenolic compound inhibit enzymes of PCR reaction,sosuccess of PCR amplifying confirmed the purity of the product and itsapplicationin molecular analysis. ExtractedDNA from our modified method is suitable in molecular study.