جداسازي و شناسايي استافيلوكوكوس اورئوس‌هاي انتروتوكسوژنيك تايپ A به ‌وسيله‌ي Multiplex PCR

Isolation and Detection of Enterotoxigenic Staphylococcus Aureus Type A by Multiplex PCR

مقدمه. استافيلوكوكوس اورئوس سموم پروتئيني و فاكتورهاي بيماريزايي خارج سلولي مختلفي توليد مي‌كند. يكي از مهمترين پروتئين‌هاي خارج سلولي، انتروتوكسين مي‌باشد كه عامل ايجاد مسموميت غذايي به وسيله‌ي اين گونه از باكتري است. اين توكسين‌ها از دستگاه گوارش به دستگاه گردش خون وارد ‌شده، سپس مركز عصبي غيرارادي استفراغ را تحريك كرده، باعث ايجاد حالت تهوع، استفراغ، دل‌پيچه و اسهال مي‌شود كه مي‌تواند باعث كم آب شدن بدن گردد. روش‌هاي مستقيم متعددي براي شناسايي انتروتوكسين‌ها وجود دارد (الايزا، روش‌هاي ايمني اگلوتيناسيون لاتكس و ...)، اما با روش‌هاي تكثير DNA [واكنش‌هاي زنجيره‌اي پليمراز mouseover=""function" onmouseout=""function" href="%22#_msocom_1"" name=""_msoanchor_1"">[-1] (PCR ] مي‌توان حضور سويه‌هاي استافيلوكوكوس اورئوس انتروتوكسوژنيك را قبل از بيان انتروتوكسين و بر اساس توالي اختصاصي ژن نشان داد. مواد و روش‌ كار. در اين مطالعه سويه‌هاي استافيلوكوكوس اورئوس جداسازي شده از نمونه‌هاي بيماران، ناقلين سالم و محيطي با آزمايش‌هاي بيوشيميايي شناسايي شدند. سپس نسبت به طراحي پرايمرهاي مورد نظر اقدام و در واكنش PCR ، ژن‌ انتروتوكسين استافيلوكوكي تايپ (A (sea و ژن نوكلئاز استافيلوكوكي ( nuc ) تكثير گرديد. قطعات تكثير يافته DNA براي ژن نوكلئاز استافيلوكوكي، 279 جفت باز و براي ژن انتروتوكسين استافيلوكوكي تايپ A ، 552 جفت ‌باز بود كه ‌توسط هضم آنزيمي مورد تأييد قرار گرفت. باكتري استافيلوكوكوس اپيدرميديس به عنوان كنترل منفي در اين واكنش مورد استفاده قرار گرفت كه فاقد هرگونه محصول در واكنش PCR بود. نتايج. در اين تحقيق 98 سويه مورد بررسي قرار گرفتند كه 89 سويه جداسازي شده با استفاده از واكنش Multiplex PCR به عنوان استافيلوكوكوس اورئوس مورد تأييد قرار گرفته، وجود ژن انتروتوكسين مورد ارزيابي قرار گرفت. شش سويه (%6/74) از استافيلوكوكوس اورئوس جدا شده، واجد ژن انتروتوكسين تايپ A بودند. نه سويه ‌ ي جداسازي شده (%9/18) كه در آزمايش‌هاي بيوشيميايي به عنوان استافيلوكوكوس اورئوس شناسايي شده بودند در بررسي مولكولي مورد تأييد واقع نشدند. بحث. اين روش سريع، حساس، اختصاصي، ارزان و متفاوت نسبت به سنجش‌هاي مرسوم بيوشيميايي و سرولوژيكي بوده، قادر است عامل توليد كننده ي انتروتوكسين استافيلوكوكي تايپ ‌ A را شناسايي نمايد.

This method is a rapid, sensitive, specific and inexpensive alternative for traditional biochemical and serological assays and can be used for detection of agent produced type A staphylococcal enterotoxin. To investigate the distribution of staphylococcal enterotoxin (sea) gene in S. aureus, 98 samples obtained from environment were analyzed by Multiplex PCR and 89 confirmed as S. aureus. Six (6.74%) S. aureus isolates were found to be positive for enterotoxin type A gene. Nine (9.18%) bacteria isolates were found to be positive for S. aureus by biochemical methods but did not confirm by molecular analysis. In this study, S. aureus strains were isolated from nose of carriers and patients, and environmental specimens were confirmed by biochemical test. Primers were designed and the PCR was used to amplify the staphylococcal enterotoxin A gene (sea) and the staphylococcal nuclease gene (nuc). DNA amplification fragments of 279 bp for the staphylococcal nuclease gene (nuc) and 552 bp for staphylococcal enterotoxin A gene (sea) was confirmed by digestion enzymes. S. epidermidis used as negative control and did not yield a PCR product. Staphylococcus aureus produces different extra-cellular protein toxins and virulence factors. One of the most important extra-cellular proteins is enterotoxin which cause staphylococcal food poisoning (SFP) effect. These toxins pass from the digestive tract to the blood circulation and consecutively activate the nerve centre of the emetic reflex, causing nausea, vomiting, abdominal cramps and diarrhea, which can lead to dehydration of the organism. Numerous detection methods are based on the evidence of the enterotoxins directly (ELISA, reversal passive latex agglutination and others), but DNA amplification methods like PCR (polymerase chain reaction) can show the presence of enterotoxigenic strains of S. aureus before the expression of enterotoxins on the base of specific gene sequences.