استفاده از روش Fast PCR جهت تشخيص گونه هاي فاسيولا

Using Fast PCR Amplification in Identifying Fasciola Species

سابقه و هدف: انگل‌هاي شايع كبدي فاسيولا هپاتيكا و فاسيولا ژيگانتيكا از عوامل ايجادكننده فاسيولايازيس بوده، كه بيماري جهاني و شايع در انسان و دام مي‌باشد. در مطالعه حاضر ما يك روش سريع، آسان و در عين حال دقيق را با استفاده از متد PCR Fast جهت تشخيص افتراقي گونه‌هاي فاسيولا هپاتيكا و فاسيولا ژيگانتيكا معرفي نموديم. مواد و روش‌ها: 30 ايزوله فاسيولا ي بالغ از كبد گاو و گوسفند از كشتارگاه‌هاي استان مازندران جدا گرديد. ناحيه ژني ITS1 با استفاده از پره ميكس هاي Amp® Fast PCR، در مقايسه با يكي از پره ميكس‌هاي متداول موجود در بازار (AccuPower® Taq PCR PreMix شركت Bioneer) تكثير شدند. به علاوه پروفايل PCR-RFLP جهت تشخيص افتراقي گونه‌هاي فاسيولا هپاتيكا و فاسيولا ژيگانتيكا با استفاده از آنزيم اندونوكلئازي TasI (Tsp509I) انجام گرفت. يافته‌ها: باندي با وزن تقريبي 463 جفت باز براي تمامي نمونه‌هاي فاسيولا با استفاده از پره ميكس Sapphire Amp® Fast PCR فقط ظرف مدت 34 دقيقه پس از تكثير به دست آمد در حالي كه تكثير اسيدهاي نوكلئيك با استفاده از پره‌ميكس متداول پس از حدود 1 ساعت و 46 دقيقه كامل شد. تمامي محصولات با آنزيم محدودالاثر (Tsp509I TasI) مورد هضم قرار گرفت. پس از هضم در فاسيولا هپاتيكا دو باند 151 و 312 جفت باز و در فاسيولا ژيگانتيكا سه باند 93، 151 و 219 جفت باز توليد شد. استنتاج: واكنش Fast PCR با استفاده از پره ميكس Sapphire Amp® در كم‌تر از 1/3 زمان استفاده از ساير پره ميكس‌هاي رايج كامل مي‌شود. روش جديد Fast PCR با استفاده از پره ميكس. Sapphire Amp® Fast PCR يك متد آسان، سريع و در عين حال دقيق بوده كه جهت تعيين و تشخيص افتراقي گونه‌هاي فاسيولادر مطالعات اپيدميولوژيك در انسان و دام‌هاي اهلي در مناطق اندميك فاسيوليازيس كاربرد دارد.

Background and purpose: Fasciola hepatica and Fasciola gigantica are common liver flukes that are the etiological agents of fasciolosis, which affects both domestic livestock and humans worldwide. In the present study we established a rapid, easy and also accurate tool, for differentiation between F. hepatica and F. gigantica using Fast PCR. Material and methods: Thirty adults of Fasciola species were isolated from sheep and cattle liver form abattoirs in Mazandaran province. ITS1 rDNA region were amplified by Sapphire Amp® Fast PCR and compared with AccuPower® Taq PCR PreMix from Bioneer. In addition, PCR-RFLP assay using Tsp509I was performed for identification of F. hepatica and F. gigantica. Results: A fragment of approximately 463bp was amplified in all of the Fasciola samples using Sapphire Amp® Fast PCR premix in just 34 minutes, while nucleic acid amplification was completed in about 1 hour and 46 minutes by Bioneer PCR master mix. All PCR products were digested with restriction enzyme TasІ (Tsp509I). After digestion, F. hepatica revealed two fragments of 151 and 312 bp while F. gigantica produced three fragments of 93, 151, and 219 bp. Conclusion: Fast PCR reaction using Sapphire Amp® Fast PCR premix was completed three times faster than the time of conventional premix. The new Fast PCR assay using Sapphire Amp® Fast PCR premix provides a simple, rapid and accurate technique for identification and differentiation of Fasciola species in epidemiological researches on human and domestic animals in endemic regions of fasciolosis.