نقش شرايط مختلف تجمع آنزيم هگزوكيناز نوع B مخمر در ساختار و سميت آن روي سلول ها

The Role of Various Aggregation Conditions in Structure and Toxicity of Type B Yeast Hexokinase Aggregates

زمينه و هدف: تشكيل رسوبات پروتئيني آميلوئيدي از ويژگي هاي مشترك گروهي از بيماري هاي وابسته به آميلوئيد از جمله آلزايمر، پاركينسون، ديابت نوع II و پريون مي باشد. نوع تجمعات تشكيل شده در شرايط مختلف و مكانيزم تخريب عملكرد سلولي توسط اين تجمعات، هنوز كاملاً مشخص نيست. در مطالعه حاضر توانايي هگزوكيناز نوع B مخمر (YHKB) براي تشكيل تجمعات منظم آميلوئيدي و يا بي شكل در شرايط گوناگون و سميت اين تجمعات روي سلول ها مورد بررسي قرار گرفته است. مواد و روش ها: در اين مطالعه تجربي براي القاي آميلوئيد از سه روش مرسوم ايجاد آميلوئيد استفاده شد. اين روش ها شامل قرار دادن (1) YHKB در pH اسيدي، دماي 55 درجه ولي با هم زدن مداوم، (2) در pH اسيدي در حضور نمك و در دماي آزمايشگاه بدون هم زدن مداوم و (3) در حضور تري فلوئور و اتانول (TFE) بودند. نوع تجمعات تشكيل يافته در شرايط فوق به وسيله توانايي شان براي اتصال با رنگ تيوفلاوين T (شاخص آميلوئيد) و شكل تجمعات با عكس برداري به وسيله ميكروسكوپ نيروي اتمي بررسي شد. همچنين سميت تجمعات تشكيل يافته در شرايط ذكر شده، به وسيله اثر دادن آن ها روي سلول هاي نروبلاستوماي انساني SH-SY5Y و از طريق روش احياي MTT مقايسه شد. يافته ها: تجمعات ايجاد شده در هر سه شرايط، توانايي اتصال به تيوفلاوين (T (ThT را داشتند ولي ميزان اتصالشان متفاوت بود. عكس هاي ميكروسكوپ نيروي اتمي (AFM) و الكتروني عبوري (TEM) نيز نشان داد كه ساختارهاي ايجاد شده از نظر ظاهري كاملاً با هم متفاوتند. تجمعات بي شكل و نامنظم اين آنزيم هم براي مقايسه با تجمعات منظم به دست آمد. سنجش سميت به وسيله روش احياي MTT نشان داد كه تجمعات بي شكل در مقايسه با كنترل سميتي براي سلول هاي نوروبلاستوما نداشتند ولي تجمعات حاصله در هر سه روش مذكور باعث تخريب سلول ها با شدت هاي متفاوت شدند. نتيجه گيري: بر اساس يافته هاي اين پژوهش، اختلاف در سميت مشاهده شده تجمعات را مي توان به اختلاف در مورفولوژي تجمعات توليدي در شرايط مختلف و مكانيزم عمل متفاوت آن ها روي سلول ها نسبت داد.

Background and Purpose: Formation of well-ordered fibrillar protein deposits is common to a large group of amyloid-associated disorders، including Alzheimer’s، Parkinson’s، type II diabetes and prion diseases. The nature of the pathogenic species and the mechanism by which the aggregation process results in cell damage are، however، not well established. In the present study، the propensity of hexokinase type B from Saccharomyces cerevisiae (YHKB) to form amyloid-like and amorphous aggregates is investigated under various conditions and their cytotoxicity is determined. Methods and Materials: In this experimental study، Amyloid-like aggregation was induced under three different conventional conditions including the preincubation of YHKB (1) in acidic pH، at 55 ºC and with agitation، (2) in acidic pH، room temperature، in presence of salt and without agitation، and (3) in the presence of trifluoroethanol (TFE). Types of aggregates in above conditions were compared for their capability to react with ThT (as a amyloid marker) and their morphology was analyzed by atomic force microscopy (AFM). Also، Cytotoxicity of the aggregates on human neuroblastoma (SH-SY5Y) were assayed by MTT reduction assay test. Results: Aggregates produced under all three conditions had ThT binding ability but with different intensity. Atomic force microscopy indicated that aggregates morphologies in various conditions were completely different. Amorphous aggregates of the enzyme were also produced for comparing with ordered aggregates. Amorphous aggregates were not found toxic to human neuroblastoma cells، as indicated by the MTT reduction assay while those formed at acidic pH and in the presence of TFE indicated cytotoxicity. Conclusions: Based on the findings، differences in cytotoxicity can be attributed to the variations in the nature and morphology of the aggregates in the conditions tested.