طراحي و ساخت كنترل داخلي جهت تشخيص يرسينيا پستيس بوسيله PCR

Back to browse issues page Design and construction of an internal control for detecting Yersinia pestis using PCR

زمينه: يرسينيا پستيس، عامل طاعون، باكتري گرم منفي، غير متحرك و كند رشد متعلق به خانواده انتروباكترياسه مي‌باشد. بر اساس طبقه‌بندي CDC اين باكتري به دليل نرخ بالاي مرگ و مير و انتقال آسان انسان به انسان در دسته A عوامل بيوتروريسمي قرار گرفته است. علي‌الرغم حساسيت و دقت بالاي PCR، ممكن است نتايج منفي كاذب به علت وجود مهاركننده موجود در نمونه‌هاي باليني مشاهده شود. هدف از اين مطالعه ساخت كنترل داخلي جهت تشخيص اختصاصي يرسنيا پستيس مي‌باشد. روش كار: در اين پژوهش، پرايمرهاي تشخيصي بر اساس ناحيه حفاظت شده‌اي از ژن‌هاي caf1 و pla توسط نرم افزار Allele ID 7.6 طراحي گشت. پرايمرهاي هيبريد براي كنترل داخلي با استفاده از توالي ژن AOX1 مخمر پيكيا پاستوريس و ژن هدف طراحي شد. واكنش PCR بر روي DNA ژنوميك يرسينيا پستيس انجام گشت. محصول آن جهت ساخت كنترل داخلي در وكتور pTZ57R/T قرار گرفت. سپس، عملكرد كنترل داخلي توسط پرايمرهاي تشخيصي مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: در الكتروفورز محصول PCR ژن‌هاي caf1 و pla به ترتيب باندهايي به طول 117 و 136 جفت باز و نتيجه تكثير كنترل داخلي caf1-IC و pla-IC به ترتيب قطعاتي با طول 227 و 250 جفت باز رويت گرديد، بنابراين محصول كنترل داخلي از نظر اندزه اختلاف مناسبي با محصول ژن‌هاي هدف دارا مي‌باشد. نتيجه‌گيري: نتايج نشان داد كنترل مثبت داخلي ابزاري مؤثر براي جلوگيري از نتايج منفي كاذب و تأييد صحت نتايج مي‌باشد.

Introduction: Yersinia pestis, a Gram-negative, non-motile and Slow growth bacterium belonging to the Enterobacteriaceae family, yersinia pestis is the causative agent of plague. It has been classified by CDC in group A of bioterrorism agents due to its high morbidity and mortality and easy person to person dissemination. In spite of sensitivity and High accuracy of PCR, false negative results can occur due to the presence of inhibitors in clinical sample. The aim of this study was to plan an internal control system for the specific detection of Y.pestis. Methods: In this study, The diagnostic primers for the F1 capsule antigen gene (caf1) and the plasminogen activator gene (pla) were designed using Allele ID 7.6 software. our target region was a conserved fragment in the pla and caf1 genes of Y. pestis. The composit primers for IC were designed using Pichia pastoris AOX1 gene sequences and target gene. The PCR experiment was performed on genomic DNA of Y.pestis. The product was cloned in the pTZ57R/T vector to construct a internal control. Then, the internal control function was evaluated By using diagnostic primers. Results: The PCR products of the pla and caf1 genes were 136bp and 117bp respectively on electrophoresis gel and length of IPC were 225bp and 227bp respectively, so there was a significant different between their size. Conclusion: The results indicate that the IC effective tool for avoid false negative results and confirm the results.