راه اندازي روش Real-time PCR بر پايهgreen SYBRجهت تعيين الل‌هاي HLA-DQ در بيماران مبتلا به سيلياك

Setup of SYBR green real-time PCR method to detect the HLA-DQ alleles in patients with celiac disease

سابقه و هدف: از عوامل ژنتيكي مهم در ابتلا به بيماري سيلياك، حضور الل‌هاي HLA-DQ2 و HLA-DQ8 در افراد مبتلا مي‌باشد. روش‌هاي مولكولي زيادي جهت تعيين اين الل‌ها در دسترس مي‌باشد اما اين روش‌ها علاوه بر هزينه بالا، داراي مراحل متعددي هستند كه استفاده از آن‌ها را دشوار كرده است، لذا هدف از اين مطالعه، راه‌اندازي تكنيك ساده و سريع جهت تعيين الل‌هاي HLA-DQ در بيماران مبتلا به سيلياك با روش SYBR g reen r eal- t ime PCR بود. مواد و روش ‌ ها: به منظور تعيين نوع HLA-DQ و ارزيابي كارايي روش SYBR g reen r eal- t ime PCR ، DNA آن دسته از بيماران سيلياكي كه بيماري آن‌ها با استفاده از روش‌هاي سرولوژي و پاتولوژي تاييد شده بود، استخراج شد. در مرحله بعد، از پرايمرهاي اختصاصي جهت بررسي الل‌هاي HLA-DQA1*05 ، HLA-DQB1*02 و HLA-DQB1*0302 استفاده شد و نتايج به‌دست آمده با كيت‌هاي تجاري در دسترس مقايسه گرديد. يافته ‌ ها: با استفاده از اين روش حضور الل‌هاي HLA-DQ2 و HLA-DQ8 با حساسيت و اختصاصي 100 درصد تعيين شد و نتايج حاصل از اين روش در مقايسه با كيت‌هاي تجاري در دسترس با قدرت تفكيك پايين، كارايي بالاتري را نشان داد. نتيجه ‌ گيري: روش SYBR g reen- r eal t ime PCR به همراه آناليز منحني ذوب آن، جهت شناسايي الل‌هاي HLA-DQ-2 و HLA-DQ8 كارايي مناسبي داشته و نسبت به روش‌هاي معمول HLA تايپينگ در ايران، سريع‌تر و آسان‌تر بوده و براي تشخيص اين الل‌ها، درجه حساسيت و اختصاصي بالايي دارد.

Introduction: HLA-DQ2 and HLA-DQ8 alleles are important genetic factors in development of celiac disease. There are many molecular techniques available to determine these alleles, but they are very complicated to perform and also cost highly. Therefore, the aim of this study was to set up a simple and quick real-time PCR based SYBR ® Green method to determine HLA-DQ alleles in patients with celiac disease. Materials and Methods: To determine HLA-DQ alleles and evaluate Real-time PCR using SYBR ® Green method for our aim, first, DNA extraction was performed for patients with celiac disease, whose diagnosis was confirmed by using serology and pathology tests. Later, the specific primers for detecting HLA-DQA1*05, HLA-DQB1*02 and HLA-DQB1*0302 alleles were used. Finally the results were compared with commercially available kits. Results: Presence of HLA-DQ2 and HLA-DQ8 alleles were determined by using this method with 100% sensitivity and specificity. Also, in comparison with low resolution commercially available kits, the results of this method were more efficient. Conclusion: Real-time PCR using SYBR® Green method with melting curve analysis is a well efficient method to identify the HLA-DQ2 and HLA-DQ8 alleles. Also, in compararison with conventional HLAtyping techniques in Iran, this method was faster and easier to performe and displayed higher sensitivity and specificity in distinguishing the alleles.