ارزيابي روش تشخيصي Real Time PCR مبتني بر آناليز منحني ذوب جهت تشخيص ايزوله‌هاي باليني استافيلوكوك اورئوس و ژن عامل مقاومت به متي‌سيلين

Evaluation of real time PCR for detection of clinical isolates of Staphylococcus aureus and methicillin-resistance strains based on melting curve analysis method

هدف: تشخيص سريع وبه موقع استافيلوكوك اورئوس مي‌تواند نقش قابل توجهي در درمان عفونت‌هاي استافيلوكوكي داشته باشد. با طراحي روش‌هاي دقيق كه داراي حساسيت و اختصاصيت قابل قبولي هستند، مي‌توان شناسايي گونه و حتي سويه‌هاي مقاوم به آنتي‌بيوتيك را انجام داد. هدف از اين مطالعه ارزيابي روش تشخيصي Real Time PCR مبتني بر آناليز منحني ذوب جهت تشخيص ايزوله‌هاي باليني استافيلوكوك اورئوس و ژن عامل مقاومت به متي‌سيلين مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه تجربي از ايزوله‌هاي باليني استافيلوكوك ذخيره شده در بانك ميكروب‌شناسي دانشگاه علوم پزشكي همدان استفاده شد. طراحي پرايمر با انتخاب سايت‌هاي هدف و ژن ITS براي استافيلوكوك اورئوس و ژن mecA براي سويه‌هاي مقاوم به متي‌سيلين صورت گرفت. جهت تعيين اختصاصيت و حساسيت آناليتيك پرايمرهاي طراحي شده از آزمون Real time PCR و روش آناليز منحني ذوب DNA سويه‌هاي مورد مطالعه استفاده شد. يافته‌ها: اختصاصيت آناليتيك پرايمرهاي طراحي شده با استفاده از آناليز منحني ذوب DNA جهت شناسايي استافيلوكوك اورئوس در 79/83 درجه سانتي‌گراد و استافيلوكك اورئوس مقاوم به متي‌سيلين در 6/76 درجه سانتي‌گراد به‌دست آمد. حساسيت آناليتيكي پرايمرهاي طراحي شده نيز بر اساس نمودارهاي حدآستانه و رقت‌هاي تعيين شده، براي ژن ITS توانايي شناسايي بيش از 15 CFU باكتري و براي ژن mecA توانايي شناسايي بيش از 25 CFU باكتري را نشان داد. نتيجه‌گيري: طراحي پرايمرهاي مناسب و به‌كارگيري تكنيك‌هاي مولكولي حساس، مي‌تواند دو عامل تعيين‌كننده در طراحي روش‌هاي سريع و دقيق جهت شناسايي باكتري‌هاي مهاجمي مانند استافيلوكوك اورئوس باشد.

Introduction: Rapid and timely detection of Staphylococcus aureus can play a significant role in the treatment of staphylococcal infections.Impresingly, by precise designing methods which have acceptable sensitivity and specificity, can identify species and even antibiotic-resistant strains. The purpose of this study was to evaluate the real time PCR diagnostic method based on the melting curve analysis for the detection of clinical isolates of S. aureus and the methicilin resistance gene. Materials and Methods: In this experimental study, clinical isolated of S. aureus was used from the Microbiology Bank of Hamadan University of Medical Sciences. The primer design was done by selecting (ITS) target for S. aureus and the mecA gene for methicillin-resistant strains. Real-time PCR and DNA melting curves analysis were used to determine the analytical specificity and sensitivity of the designed primers. Results: The analytical specificity of the primers was 83.79 ° C for S. aureus and 76.6 ° C for methicillin resistant Staphylococcus aureus respectively. The analytical sensitivity of the primers was 15 CFU/ml bacteria for ITS gene and 25 CFU/ml bacteria for mecA gene. Conclusion: By selecting appropriate primers and using sensitive molecular techniques, which could be the main factors for designing of both quick and accurate method, it is possible to identify invasive bacteria such as S. aureus.