جداسازي باكتري هاي توليد كننده آنزيم ليپاز از چربي شير گاو و بهينه سازي اثر متغيرهاي تاثير گذار بر توليد آنزيم ليپاز در تخمير غوطه وري

Isolation of lipase producing bacteria from fat milk and optimization of various parameter effect on lipase enzyme production in submerge fermentation

25 سويه باكتري ليپوليتيك از نمونه چربي شير جداسازي شد. بهترين سويه براساس اينكه توليد ليپاز آن با مقدار U/mL177 نسبت به سويه هاي ديگر بيشتر است براي شناسايي و مطالعات بعدي انتخاب گرديد. اين سويه از طريق روش توالي يابي ژن16 SrRNA بيشترين شباهت به سويه باسيلوس سوبتيليس شناسايي شد. به منظور توليد آنزيم ليپاز با صرفه اقتصادي بهينه سازي با استفاده از روش سطح پاسخ صورت پذيرفت. غربال سازي تركيبات محيط كشت و عوامل تاثير گذار بر تخمير از طريق روش آماري پلاكت برمن انجام گرديد. در اين تخمير يازده فاكتور (روغن زيتون، عصاره مخمر، پپتون، منيزيم كلريد، گلوكز، شربت ذرت، ملاس، روغن كنجد، روغن سياه دانه، سرعت چرخش و روغن آفتابگردان ) غربال سازي شد و سپس بهينه سازي انجام شد. پس از بهينه سازي، نقطه بهينه محيط كشت شامل 25% روغن كنجد، 25/2% روغن زيتون، mM25 منيزيم كلريد و 1% عصاره مخمر (rpm160، pH5/6، 37 درجه سانتيگراد به مدت 24 ساعت) شد و فعاليت آنزيمي U/mL574 گزارش شد. پارامترهاي كينتيكي Vmax و Km آنزيم ليپاز خام به ترتيب برابر با mM/min.mL 667/0 و mM 62/1 از طريق نمودار معادله ميكائيليس- منتن محاسبه شد.

Fat milk sample was selected to isolationg lipolitic bacteria. 25 strains were isolated from fat milk. The best isolate was selected for identifing and further study according to lipase producing with amount of 177 U/ml lipase activities that was the most lipase activity among bacteria strains. This bacterium was identified as a strain of genus Bacillus based on morphological and biochemical characterization and 16S rRNA gene sequence. Optimization was done for economical producing of lipase by Respone Surfase Method. After optimization, screening of culture parameters was conducted by Placket Burman Design. The effect of oive oil, yeast extract, peptone, Mgcl2, glucose, corn syrop, molase, sesame oil, black seed oil, rotation speed and sunflower oil was investigated for optimization. The optimum lipase activity (574 U/ml) was achieved at optimum levels of factors of sesame oil (25.0w/w), olive oil concentration (22.5 g/L), yeast extract (10 g/l) and Mgcl2 (25 mM/l) (160 rpm, pH 6.5 and 24 h) that lipase activity increased to 3.24-fold. Kinetic parameters, Km and Vmax for the purified lipase was calculated from the Michaelis–Menten plot. The lipase showed lower Km value (1.62 mM) and high Vmax value (0.667 mM/min) than the other Bacillus subtilis.