ارزيابي همبستگي بين كيفيت و ميزان RNA ويروسي استخراج شده از شيرخام با ميزان ماده خشك شيرخام به منظور شناسايي ملكولي ويروسهاي روده اي براساس مدل سطح پاسخ

Evaluation of correlation between quality and amount of the extracted viral RNA from raw milk with the amount of raw milk dry Matter for molecular detection of enteric viruses using response surface model

امروزه حضور ويروس هاي روده اي به عنوان عامل ايجاد بيماري درآب و بعضي از مواد غذايي به اثبات رسيده است . شيرخام جزء آن دسته از مواد غذايي است كه مي تواند به صورت بالقوه ناقل ويروسهاي روده اي باشد . فقدان هر گونه روش مشخص به منظوربازيافت و استخراج اين ويروسها از شيرخام سبب شده است تا در اين پژوهش در قدم اول تاثير ميزان ماده خشك شيرخام روي كيفيت و ميزان RNA ويروسي استخراج شده مورد بررسي قرار گيرد. بدين منظور براساس روشهاي متداول جداسازي اجزاء و تركيبات شير ، به طور وارونه نسبت به ساخت چهار محلول مدل شير خام برمبناي اجزاء و نسبتهاي طبيعي شير خام اقدام و محلولهاي مدل حاصل توسط كلي فاژ MS2 به عنوان بهترين ويروس مدل براي ويروس هاي روده اي، در غلظتهاي 104´ 3/1 ، 102´ 3/1، 3/1، 2-10´ 3/1، 4- 10´ 3/1پلاك در هر ميلي ليتر تلقيح شد. با استفاده از روش پايه فنل- تيوسيانات گوانيدين – كلروفورم نسبت به جداسازي و استخراج RNA ويروسي از محلولهاي مدل شير خام اقدام و كيفيت و ميزان RNA استخراج شده تحت 12 تكرار توسط دستگاه اسپكتروفتومتر نانو دراپ اندازه گيري شد. نتايج حاكي از آن بود كه از محلول مدل شيرخام كامل ( حاوي چربي) در غلظتهاي ويروسي برابر، بيشترين ميزان RNA ويروسي استخراج شده است ، در حاليكه بين اجزاء محلولهاي مدل ، كازئين و پروتئين هاي آب پنير بيشترين بازدارندگي را در استخراج RNA ويروسي دارند. همچنين بالاترين كيفيت RNA استخراج شده به منظور شناسايي ملكولي ويروس هاي روده اي مربوط به محلول مدل شير خام كامل ( حاوي چربي ) مي باشد . نتايج همچنين نشان دادند كه براساس مدلهاي سطح پاسخ ( پلي نوميال )، همبستگي بالايي بين ميزان استخراج RNA ويروس با ميزان ماده خشك محلولهاي مدل شيرخام و غلظت تلقيح ويروس (96/0(R= و همچنين بين كيفيت RNA استخراج شده با ميزان ماده خشك محلولهاي مدل شيرخام و غلظت تلقيح ويروس( 92/0 (R= وجود دارد.

Nowadays, presence of enteric viruses in water and some foods is proved as a cause for infectious diseases. Raw milk can transmit enteric viruses potentially. Lack of distinct protocol for recovery and extraction of these viruses from raw milk made us to evaluate the effect of dry matter amount on quality and amount of viral RNA yield. Therefore according to reverse of routine protocols in separating of milk components, we prepared four milk model solutions in different combinations and ratios based on natural raw milk components. Then, each milk model solution was spiked with five levels of MS2 coliphage (1.3×104, 1.3 ×102, 1.3, 1.3×10-2, 1.3 ×10-4 pfu/ml). We isolated the viral RNA from each milk model solution using phenol - guanidine thiocyanat - chloroform method. Also we measured quality and RNA extraction Yield in twelve frequencies by nanodrop spectrophotometer. The results showed that in the equal viral concentration, the most amount of viral RNA was extracted from whole milk model solution (including fat). Whereas casein and whey proteins had the most inhibition in the viral RNA extraction .Also the highest quality of the extracted RNA for molecular detection was related to whole milk model solution. Based on response surface model (polynomial) RNA extraction yield and quality of the extracted RNA were closely correlated to the amount of dry matter of milk model together with coliphage concentration (R=0/96 and R= 0/92 respectively).