ارزيابي بيان نوتركيب زنجيره سبك توكسين بوتولينوم تيپ ‌A‌ متصل به يك پپتيد ‌ نفوذ كننده به سلول ‌

Evaluation of the Expression of Recombinant Type A Botulinum Neurotoxin Light Chain Loaded onto a Cell-Penetrating Peptide

سابقه و هدف: توكسين بوتولينوم تيپ A امروزه به طور گسترده اي به صورت تزريقي در درمان برخي اختلالات انقباضي ماهيچه‌هابه كار مي رود.اين مطالعه به منظور توليدپروتئين نوتركيب حاصل از اتصال كوالان زنجيره سبك توكسين بوتولينوم تيپ A (BoNT/A) به پپتيد TAT(47-57)وهمچنين شرايط مناسببراي افزايشبيان و تخليص اين پروتئين انجام شد. مواد و روش­ ها:در اين مطالعه بنيادي توالي نوكلئوتيدي زنجيره سبك توكسين بوتولينوم تيپ A و پپتيد TATاز بانك‌ ژني به دست آمد وسازه ژني حاوي اينتوالي‌هاطراحي و ساخته شد. پس از كلون سازي در وكتور بياني BL21 (DE3)E. coli القاي بيان با استفاده از IPTG انجام گرفت.سپس شرايط بهينه دمايي و غلظت مناسب IPTGبراي بيشترين ميزان بيان بر اساس تفاوت در شدت رنگ ميان باندهاي پروتئيني ژل درSDS PAGEتعيين شد. پروتئين نوتركيببا كمك ستون كروماتوگرافي حاوي نيكل (Ni-NTA) تخليصشد. يافته ها: پروتئين كايمريك حاصل در شرايط معمول بيان (mM IPTG 1و دماي C˚37) به صورت نامحلول توليد مي شود. با بهينه سازي شرايط بيان (mM IPTG 5/0و دماي C˚18)ميزان 60% ازپروتئين كايمريك به صورت محلول توليد شد. نتيجه گيري: بر اساس نتايج اين مطالعه با بيان پروتئين نوتركيب به صورت محلول پروتئين پيچش صحيح و در نتيجه فعاليت خود را به ميزان زيادي حفظ كرده و نيازي به استفاده از تركيبات دناتوره كننده براي باز كردن پيچش پروتئين و محلول سازي آن نخواهد بود.

BACKGROUND and OBJECTIVE: Botulinum toxin type A (BoNT/A) is widely used in the treatment of some muscle contraction disorders through injection. This study aimed to produce recombinant protein through covalent bonding of the light chain of BoNT/A to the peptide TAT (47-57), and to create an optimized condition for expression and purification of the protein. METHODS: In this preliminary study, the nucleotide sequences of the light chain of BoNT/A and TAT peptide were obtained from Gen Bank, and genetic structures containing these sequences were designed and engineered. After cloning into the BL21 (DE3) E. coli vector, expression was induced by IPTG. Thereafter, optimum thermal condition and IPTG concentration for maximum expression were determined based on the difference in the intensity of staining between the bands on SDS-PAGE protein gel. The recombinant protein was purified through nickel column chromatography (Ni-NTA). FINDINGS: The produced chimeric protein is insoluble in normal conditions (1 mM IPTG and at 37˚ C). Through optimization of expression conditions (0.5 mM IPTG and at 18˚ C) 60% of the chimeric protein was produced as solution. CONCLUSION: Based on our results, through expressing the recombinant protein as a solution, the protein maintained its proper folding and function. Hence, the use of denaturation compounds for solution making and destabilization of folded protein structures is not required. KEY WORDS: Light chain of botulinum toxin type A, Cell-p