شناسايي و رديابي مولكولي Phytophthora melonis بر اساس ژنوم هسته اي و ميتوكندريايي

Molecular Identification and Detection of Phytophthora melonis Based on Nuclear and Cytoplasmic Genome

گونه ي بيمارگر گياهي Phytophthora melonis از نظر ريخت شناختي به برخي گونه هاي بدون پستانك جنس Phytophthora به خصوص P. drechsleri شباهت دارد و بنابراين تفكيك اين آرايه هاي هم گرا دشوار است. اين پژوهش به منظور طراحي آغازگرهاي اختصاصي P. melonis بر اساس ژنوم هسته اي و ميتوكندريايي، بررسي اختصاصيت آن ها در برابر ساير گونه هاي همگرا، و بهينه سازي استفاده از اين آغازگرها براي رديابي P. melonis انجام شد. براي طراحي آغازگر هاي اختصاصي گونه ي P. melonis نُه ژن هسته اي و چهار ژن ميتوكندريايي از نظر تفاوت نوكلئوتيدي مناسب بودند، بنابراين سيزده آغازگر اختصاصي طراحي و خصوصيات آن ها بهينه سازي گرديد. رديابي P. melonis با استفاده از پنج جفت از آغازگر هاي اختصاصي در بافت مايه زني شده ي گياهان ميزبان آن شامل خيار، خربزه، هندوانه، چغندر قند و پسته انجام شد. با استفاده از آغازگرهاي طراحي شده در واكنش زنجيره اي پليمراز تودرتو، تا سطح يك درصد مايه ي بيماري زا در خاك آلوده و زئوسپورهاي بيمارگر تا غلظت 10 زئوسپور در ميلي ليتر در آب آلوده رديابي شدند. با بررسي اختصاصيت و حساسيت آغازگر هاي طراحي شده، كارامد ترين آن ها مجموعه ي ITS-M2 (تركيب آغازگرهاي ITS-MF1 و ITS-MR2) در نظر گرفته شد. دماي هم جوشي بهينه سازي شده براي اين مجموعه 68 درجه ي سلسيوس بود. به نظر مي رسد استفاده از واكنش زنجيره اي پليمراز تودرتو با استفاده از مجموعه ي ITS-M2 به همراه آغازگر هاي عمومي ITS4 و ITS6 در نقش آغازگر هاي خارجي در حدود 106 برابر حساس تر از واكنش زنجيره اي پليمراز مستقيم است. آزمون زنجيره اي پليمراز چندگانه ي طراحي شده، قادر به رديابي هم زمان سه گونه ي بيمارگر شامل P. melonis، P. drechsleri و P. nicotianae بود.آزمايش ها نشان داد كه آغازگر هاي طراحي شده ابزاري كارآمدي براي رديابي P. melonis در بافت گياه، خاك و آب آلوده هستند.

The plant pathogen Phytophthora melonis is morphologically similar to some other non-papillate Phytophthora spp. especially P. drechsleri and therefore it is difficult to discriminate these convergent taxa. This study was performed to design specific primers based on nuclear and cytoplasmic genome, examine their specificity against other convergent species, and optimize the specific primers’ conditions to detect P. melonis. Nine nuclear and four cytoplasmic genes were appropriate to design thirteen specific primers based on their nucleotide polymorphism. PCR conditions were optimized. Phytophthora melonis were detected by specific primers in inoculated plants such as cucumber, watermelon, melon, sugar beet and pistachio. All specific primers detected pathogen in 1:100 (pathogen: soil) inoculated soil.Up to 10 zoospores per milliliter were detected using nested polymerase chain reaction. ITS-MF1 and ITS-MR2 (ITS-M2 set, from internal transcribed spacers of rRNA gene) were selected as the most efficient primers based on their specificity and sensitivity. The optimized annealing temperature for this primer set was 68 °C. It seemed that nested PCR by ITS-M2 primer set together withthe universal primers ITS6 and ITS4 as external primers is at least 106 times more sensitive than simple PCR. Multiplex polymerase chain reaction simultaneously detected the three cucurbits’ pathogens including P. melonis, P. nicotianae and P. drechsleri. This study showed that the designed primers could be effective tools for detection of P. melonis isolates from infected tissues, and infested water and soil.