استفاده از سيستم CRISPR/Cas9 براي دستكاري ژن SGR فستوكاي بلند بر اساس بيان موقت

Transient expression-based CRISPR/Cas9 system for manipulation of tall fescue SGR gene

سابقه و هدف: يكي از فناوري هاي پيشرفته در ويرايش ژنوم، مربوط به فناوري تكرارهاي كوتاه پاليندرومي فاصله دار منظم خوشه اي است. در اين پژوهش RNA راهنماي مربوط به ژن SGR درگير در تجزيه كلروفيل، در تماس نزديك با پروتئين Cas9 در سازه CRISPR براي هدف قرار دهي اين ژن در برگ هاي فستوكاي بلند قرار گرفت. مواد و روش‌ها: در راستاي ساخت سازه CRISPR/Cas9 قابل برنامه ريزي براي هدف گيري ژن SGR، ابتدا يك توالي 20 نوكلئوتيدي روي اگزون ژن SGR فستوكاي بلند انتخاب گرديد. اين توالي ابتدا در سازه pEnChimera جاسازي و سپس به وسيله فناوري Gateway به حامل بيان منتقل گرديد. حامل مد نظر پس از تاييد به وسيله واكنش زنجيرهاي پلي مراز و توالي يابي، به Agrobacterium tumefaciens براي آزمايش هاي بيان موقت منتقل گرديد. در گام دوم سازه CRISPR و سازه تشديد بيان (pB2WG7) داراي ناحيه رمز كننده ژن SGR به طور همزمان به برگ هاي توتون به وسيله روش Agroinfiltration‌ منتقل گرديد. ناحيه آلوده شده پس از استخراج DNA توالي يابي شد. در آزمايشي ديگر سازه CRISPR طراحي شده به طور مستقيم و به صورت موقت در برگ هاي بالغ جوان فستوكاي بلند تحت تنش، بيان گرديد. يافته‌ها: واكنش زنجيره اي پلي مراز و توالي يابي، جايگيري درست RNA راهنما را در دو حامل به كار رفته در اين آزمايش تاييد مي-نمايد. بيان موقت همزمان دو سازه در برگ هاي توتون كه با استفاده از استخراج DNA و توالي يابي از محل آلوده ارزيابي شد، نشان مي‌دهد كه با وجود قرار گيري درست توالي در اين سازه در عمل قادر به برش ژن SGR فستوكاي بلند بيان شده در گياه توتون نمي باشد. ولي در آزمايش دوم بيان موقت سازه CRISPR/Cas9 در برگ هاي فستوكاي بلند داراي ژن طبيعي SGR بيانگر اين است كه اين سازه به شكل جالبي قادر به توقف بيان ژن SGR و در نتيجه توقف تجزيه كلروفيل برگهاي فستوكاي بلند در مقايسه با شاهد مي‌باشد. نتيجه‌گيري: استفاده از فناوري Gateway به ميزان چشمگيري در مقايسه با روش آنزيم هاي برشي سرعت و دقت در ساخت سازه نهايي CRISPR/Cas9 را بالا برد. فناوري CRISPR/Cas9 زماني كه روي برگ هاي توتون براي هدف قرار دهي ژن SGR فستوكاي بلند استفاده شد موفقيت آميز نبود كه به احتمال به دليل بيان غير هدفمند در موجودي است كه ژن SGR به طور طبيعي در آن وجود ندارد ولي زماني كه سازه به صورت موقت در برگ هاي داراي ژن اصلي SGR (فستوكاي بلند) بيان شد نتايج مشاهده شده به طور آشكاري بيانگر اين بود كه ژن SGR فستوكاي بلند به وسيله CRISPR‌ غير فعال گرديده و در نتيجه آن در شرايط تنش برگ هاي فستوكاي بلند سبزتر باقي ماندند.

Background and Objectives A clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) is one of the precise genome editing techniques. In present experiment guide RNA associated to the tall fescue SGR gene (FaSGR) joint to the Cas9 protein in CRISPR system so as to target SGR in tall fescue ((Festuca arundinacea 'Jaguar ′) leaves. Materials and methods In order to construct programmable CRISPR/Cas9 system for targeting FaSGR, 20 nucleotides of exon originated FaSGR gene were selected. This 20 bp firstly integrated into pEn/Chimera vector followed by LR reaction (gateway system) in which aforementioned segment transferred into the ccdB frame of expression vector. Sequenced and PCR certified vector by gene specific primers (GSPs) then inserted to the GV 3101 strain of Agrobacterium tumefaciens. For construction of overexpression vector (OE) of SGR gene, full length of FaSGR was isolated from tall fescue leaf through gene specific primers and after cloning in E-Coli integrated into pB2WG7 vector using Gateway technology. In second step CRISPR construct and overexpression pB2WG7 vector harboring full length of FaSGR, co-transformed into tobacco leaves through agroinfiltration method. DNA extracted from agro-infected area and sequenced by gene specific primers. In other experiment CRISPR /Cas9 construct transiently and directly expressed in young mature tall fescue leaves subjected to abiotic stress. Results: Polymerase chain reaction and DNA sequencing strongly support guide RNA order in two vectors. Transient co-expression of two separate vectors in tobacco leaves after receiving DNA extraction and sequencing data, vividly showed, although the segment sequence and order of guide RNA is fine but no deletion in FaSGR gene was observed by applying CRISPR/Cas9 system. However in second experiment transient expression of CRISPR/CAS9 in tall fescue leaves which having natural FaSGR gene under vacuum pressure surprisingly suppress SGR expression whereupon improve tall fescue leaf color quality compared to control leaves. Conclusion: Gateway technology which has been used in this experiment greatly improved preciseness of CRISPER/Cas9 construct design and shorten times in contrast to that of restriction enzymes method. On model plant tobacco CRISPR/Cas9 was not successful in order to cut FaSGR gene on target site. This likely can be due either to the heterologous expression of this gene in untargeted organisms or different promoter governs genes. However, when we applied this transient expression-based genome editing system on tall fescue leaves under vacuum, we clearly observed FaSGR inactivated by CRISPR/Cas9, as a result tall fescue leaves stayed much greener under salt and heat stress than control.