ساخت و آناليز بيان ناقل گياهي pCaBGi

Construction and expression analysis of plant binary vector pCaBGi

بيان موقت مبتني بر تزريق اگروباكتريوم در برگ گياه روش نسبتاً سريع و قابل اعتمادي براي آناليز توالي‌هاي تنظيمي است. به منظور بهره‌گيري از مزاياي اين تكنيك يك ناقل بياني مناسب براي انجام آزمون بيان موقت عناصر تنظيمي مبتني بر تزريق اگروباكتريوم مورد نياز است. در اين مطالعه بمنظور ساخت يك ناقل بياني گياهي، جايگاه‌هاي آنزيمي مناسب از وكتور pBGi به عنوان قطعه در نظر گرفته شد و وكتور pCAMBIA3301 حامل ژن گزارشگر GUS پس از حذف پرموتر CaMV 35S به عنوان توالي پايه استفاده شد. وكتور جديد به نام pCaBGi از طريق وارد نمودن قطعه BamHI/SnaBI از وكتور pBGi به جاي قطعه BamHI/SnaBI در وكتور pCAMBIA3301 ساخته شد. تاييد ناقل جديد با استفاده از روش كلني PCR و توالي يابي بوسيله آغازگرهاي PSh4-F2/R انجام شد. عدم بيان ژن گزارشگر در ميزبان پروكاريوتي با سنجش فعاليت آنزيم بتاگلوكورونيداز در سويه GV3101 اگروباكتريوم به عنوان يك سيستم پروكاريوتي تاييد شد. تزريق سلول‌هاي اگروباكتريوم حامل وكتور pCaBGi در برگ توتون بيان پايه بسيار جزئي ناشي از فعاليت توالي حداقل پروموتري مشاهده شد. توالي وكتور pCaBGi با استفاده از برنامه sequin با شماره بازيابي MG719235 در بانك ژن ثبت شد.

Transient expression in the plant leaf cells is a relatively fast technique to analyses regulatory sequences. To gain the approach advantages, a convenient expression vector would be needed for transient analysis of regulatory elements. In this study, to construct such a vector we used pBGi which provides the regulatory elements cloning site::minimal promoter as insert and pCAMBIA3301 that after removing the CaMV 35S promoter was used as backbone. The new vector, pCaBGi was constructed by replacing BamHI/SnaBI fragment (cis-acting cloning site::Minimal promoter) of pBGi with a BamHI/SnaBI fragment (CaMV 35S promoter) isolated from the pCAMBIA3301. The recombinant colonies were screened using colony PCR with and accuracy of the construction steps has been confirmed by sequencing using PSh4-F2/R specific primers. GUS assay showed that the intron containing GUS gene do not expressed agrobacterium strain GV3101 as a prokaryotic system. Injection of GV3101 harboring pCaBGi in tobacco leaves showed very low Basal expression of minimal promoter. The Sequence of pCaBGi has been submitted to gene bank using sequin software with the Accession number MG719235.