توليد رده سلولي K562 بيان كننده اندونوكلئاز Cas9 (CRISPR-associated9)

Generation of K562 cell line expressing Cas9 endonuclease (CRISPR-associated9)

سابقه و هدف امروزه ژنوم رده‌هاي سلولي به منظور ايجاد مدل‌هاي بيماري و درمان آن‌ها ويرايش مي‌شود. البته بزرگي ژن Cas9 موجب مشكلاتي از جمله پايين بودن كارآيي سيستم CRISPR شده است. براي حل اين مشكل، رده‌هاي سلولي بيان‌كننده Cas9 توليد شده‌اند كه در آن‌ها تنها بايد بخش RNA راهنماي CRISPR به سلول ترانسفكت شود. مواد و روش‌ها در اين مطالعه تجربي، قطعه PGK-PURO/CMV (PPC) با PCR از وكتور pAAVS1-puro-DNR تكثير شده و در وكتور pTG19-Tهمسانه‌سازي شد. سپس قطعه PPC از اين وكتور با آنزيم‌هاي KpnI و EcoRI خارج شد. وكتور pCas-Guide-AAVS1 نيز تحت برش آنزيمي مشابه قرار گرفت و اتصال آن با قطعه PPC منجر به ساخت وكتور pPPC-Cas گرديد. پس از بهينه كردن شرايط الكتروپوريشن، وكتور pPPC-Cas به درون سلول‌هاي K562 الكتروپوريت شد و سلول‌هاي مقاوم به پرومايسين انتخاب شدند و ميزان بيان Cas9 در آن‌ها با Real-time PCR بررسي شد. يافته‌ها با PCR قطعه‌اي به طول 2514 جفت باز تكثير شد. وكتورpPPC-Cas طي دو مرحله همسانه‌سازي ساخته شد. سلول‌هاي ترانسفكت شده مقاوم به پرومايسين انتخاب شدند. انتخاب كلوني در ادامه انجام شد و سه كلوني كه نسبت به هم بيان‌هاي بالا، متوسط و پايين داشتند، انتخاب شدند. نتيجه گيري در اين مطالعه سلول‌هاي K562 بيان‌كننده Cas9 به دست آمدند كه از آن‌ها مي‌توان در مطالعه‌هاي آتي‌ژنوميك عملكردي و نيز توليد مدل‌هاي سلولي بيماري‌هاي انساني استفاده كرد.

Background and Objectives The genome of cell lines is nowadays edited to create disease models and treat them. Of course, the size of the cas9 gene has caused problems like the low efficiency of the CRISPR system. To solve this problem, Cas9 expressing cell lines have been generated in which CRISPR RNA should only be transfected to the cell. Materials and Methods This article is experimental. PGK-PURO / CMV (PPC) fragment was amplified with PCR from pAAVS1-puro-DNR vector and cloned in pTG19-T vector. The PPC fragment from this vector was removed by KpnI and EcoRI enzymes. Also the pCas-Guide-AAVS1 vector was subjected to the same enzymatic cutting and its attachment to the PPC fragment resulted in the production of the pPPC-Cas vector. After optimizing the electroporation conditions, the pPPC-Cas vector was electroporated into K562 cells and puromycin -resistant cells were selected and Cas9 expression level was evaluated by Real-time PCR. Results A PCR fragment of 2514 bp was amplified. The vector pPPC-Cas was cloned in two steps. puromycin -resistant transfected cells were selected. Clonal selection was carried out and three colonies with high, medium and low expression level of Cas9 were isolated. Conclusions The Cas9-expressing K562 cells derived in this study can be applied both for functional genomic researches and design cellular models of human diseases in future.