بهينه‌سازي بيان سم شقايق دريايي (فراگاسياتوكسين C) در باكتري E.coli سويه BL21

Optimization of Sea Anemone Toxin (fragaceatoxin C) Expression in E.coli BL21

سابقه و هدف: شقايق دريايي از جنس اكتينيا در مناطق جزري سواحل صخره‌اي شمال اسپانيا بسيار متداول است. اكتينيا فراگاسيا يكي از گونه‌هاي مهم است كه پروتئين سمي فراگاسياتوكسين C را جهت دفاع و شكار ترشح مي‌كند. هدف اصلي از اين مطالعه، انتقال پلاسميد حاوي ژن كدكننده فراگاسياتوكسين C به اشيرشياكلي سويه BL21، بيان و يافتن شرايط مطلوب بيان مي‌باشد. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه تجربي براي انتقال شيميايي، باكتري‌ها جهت جذب پلاسميد حاوي ژن FraC به‌وسيله كلسيم كلرايد سرد شسته و جهت اطمينان از انتقال پلاسميدها، باكتري‌ها روي محيط حاوي آنتي‌بيوتيك مناسب (آمپي‌سيلين) كشت داده شدند. براي اطمينان بيش‌تر، استخراج پلاسميدها در حجم كم با استفاده از كيت استخراج پلاسميد GF-1 صورت گرفت. سپس تحت برش آنزيم‌هاي NcoI وHind ІІІ و هم‌چنين كنترل PCR قرار گرفتند. بعد از تأييد حضور پلاسميد حاوي ژن FraC در باكتري ميزبان، باكتري‌ها جهت يافتن شرايط مطلوب بيان پروتئين FraC توسط IPTG 1mM در زمان‌هاي مختلف و دماي cº20 القا شدند. پس از جمع‌آوري باكتري‌هاي بيان‌كننده FraC در زمان‌هاي مختلف، بيان آن‌ها روي ژل سديم دودسيل سولفات پلي‌آكريل آميد(SDS-PAGE) مشهود بود. يافته‌ها: نتايج ما نشان داد كه پلاسميد حاوي ژن FraC با موفقيت انتقال يافت. هم‌چنين نتايج SDS-PAGE نشان داد كه FraC در زمان‌هاي 6 و 8 ساعت با استفاده از IPTG 1mM در دماي cº20 بيش‌ترين بيان را دارند. استنتاج: با توجه به نتايج، هر دو مرحله انتقال شيميايي تأثير قابل توجهي در كارايي انتقال دارند. رعايت اصول و دماي مطلوب مي‌تواند ما را دريافتن شرايط مطلوب براي بيان هر پروتئين خاص در باكتري‌ها ياري كند.

Background and purpose: Sea anemones of the genus Actinia are commonly found in the intertidal zone of the northern rocky coast of Spain. Actinia fragacea is one of the most important species that secretes a toxic protein, fragaceatoxin C (FraC), for defense and hunting purposes. The aim of this study was transformation of plasmid containing the gene encoding the FraC to Escherichia coli bacterial strain BL21, and identifying optimum expression condition. Materials and methods: In this experimental study, chemical transformation was conducted by washing the bacteria with cold calcium chloride to take up the plasmid containing the FraC gene. To ensure the transformation of plasmids, bacteria were grown on a medium containing an appropriate antibiotic (ampicilin). For greater certainty, the minipreparation of transformed plasmids was done using GF-1 plasmid extraction Kit. The plasmids were then went under digestion check using NcoІ and Hind ІІІ enzymes and PCR check. After confirming the presence of a plasmid containing FraC in the host bacteria, the bacteria were induced by 1mM IPTG in different times at 20 ºC to find the optimum expression conditions. After collecting bacteria expressing FraC at different times, its expression was visualized on Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE). Results: Our results showed that the plasmid containing the FraC was successfully transformed. Also SDS-PAGE results indicated that the FraC was successfully expressed at times of 6 and 8 h using 1mM IPTG at 20 ºC. Conclusion: According to the results, both steps of chemical transformation had significantly influenced the transformation efficiency. Following the principles and selecting optimum temperature could help us in finding the optimum conditions for expression of each specific protein in bacteria.