شناسايي و بيان نوتركيب ايزوفرم ژني سنتز كننده كروسين در كلاله زعفران

Identification and Recombinant Expression of Crocin Synthesis Isoform Gene in Saffron Stigma

وجود ايزوفرم­ هاي ژني مختلف در گياهان منجر به ايجاد ايزومرهاي مختلف از متابوليت­ ها به مانند متابوليت ­هاي گليكوزيله شده مي­ گردند. در تحقيق حاضر به شناسايي و بيان هترولوگ ايزوفرم ژني كدكننده آنزيم گليكوزيل ترانسفراز كلاله گياه زعفران در مرحله گرده افشاني پرداخته شد. نتايج حاصل از توالي‌يابي و آناليز­هاي بيوانفورماتيكي توالي ژني جدا شده از ژنوم گياه زعفران با استفاده از آغازگرهاي هرزگرد نشان داد كه اين توالي ژني با اندازه 1368 جفت باز متعلق به خانواده پروتئيني گليگوزيل ترانسفرازها بوده كه بصورت آپو‌پلاستي در سلول ترشح مي­ گردد. جهت بررسي عملكرد آنزيمي، ابتدا توالي كامل ژني ايزوله شده با تكنيك Gibson Assembly در وكتور بياني pThio-UGT تحت پروموتر القايي آرابينوز، ساب­كلون شده و با روش الكتروپوراسيون در سويه باكتريايي BL21- pGro كه بيان­ كننده پروتئين­ هاي چاپروني با زيرواحدهاي EL و ES بود ترار ريخت گرديد. پروتئين­ هاي بياني به دنبال تخريب ديواره باكتري با روش فراصوت و سوسپانسيون­ سازي رسوب باكتري در محلول PBS، به روش جوشانيدن استخراج شد. نهايتاً جداسازي پروتئين­هاي نوتركيب با بارگذاري روي ژل 10%SDS-PAGE نشان داد كه حاصل بيان هترولوگ ايزوفرم ژني آنزيم گليكوزيل ترانسفراز پروتئيني با وزن مولكولي kDa 69/5 مي‌باشد. نتايج حاصل از اين پروژه مي ­تواند در تعيين استراتژي­هاي اصلاح نژادي براي بهبود صفات كيفي و كمي مانند رنگ و عطر در گياه زعفران به­ كار گرفته شوند.

The existence of isoform genes in plants led to creation of the different types of isomeric metabolites like these glycosylated forms. This study was conducted to investigate the identification and heterologous expression of Saffron stigmas Glycosyl transferase coding isoform gene during the pollination stage. The results have been obtained by sequencing and bioinformatics analysis of an isolated gene from saffron genomes by degenerate oligo’s revealed that the gene is in1283 bp length and belongs to the CsUGT protein family which has Apo-plastic secretion in the cell. To evaluate the enzymatic function, firstly the isolated sequence was sub-cloned under arabinose induce promoter in pThio-UGT expression vector by the Gibson assembly technique. Then, the recombinant vector transformed into BL21-pGro7 bacteria which were able to express chaperon proteins with EL& ES subunits. Followed by destructing the bacteria cell wall via ultrasound, the pellet was suspended by PBS solution and then the soluble proteins were extracted by the boiling method. Finally, the protein electrophoresis by SDS pages 10% showed that the recombinant protein of CsUGT expressed correctly in bacteria with 69.5 kDa molecular weight. The results obtained in this project could be applied to determine the breeding's strategies to improve qualitative and quantitative traits such as color and aroma in saffron.