كلونينگ ژن كد كننده پروتئين نوكلئوكپسيد ويروس سپتي سمي هموراژي در باكتري اشيرشياكلي براي تشخيص بيماري VHS در ماهيان قزل آلاي رنگين كمان

Cloning and expression of viral haemorrhagic septicaemia nucleocapsid (N) gene of Rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) in Escherichia coli

بيماري ويروسي سپتي سمي هموراژي (VHS) يكي از مهم ترين بيماري هاي اين ماهي است كه اخيرا در ايران شيوع گسترده-اي يافته وخسارت هاي بسيار سنگيني را بر پرورش دهندگان تحميل كرده است. به منظور شناسايي و اطمينان از وجود عامل بروز اين تلفات، نمونه برداري از مزارع پرورشي استان چهارمحال و بختياري- كه كانون اصلي همه گيري و تلفات بالا بود صورت گرفت. ماهيان داراي علايم باليني انتخاب و اندام هاي، كليه قدامي، طحال، قلب و مغز آن ها جدا و در الكل 70 درصد ذخيره شدند. بر اساس آزمايش RT-PCR، بيماري VHS تاييد شد؛ سپس براي استفاده در بررسي سرولوژيك VHS، يك قطعه از ژن نوكلئوكپسيد(N) ويروس VHS، با پرايمرهاي پيشنهادي OIE و اندكي تغيير، تكثير و قطعه مورد نظر در وكتور PMAL-C2X كلون و سپس در باكتري اشيرشياكلي Rosetta بيان گرديد. پروتئين بياني با كمك ستون كروماتوگرافي رزين آميلوز خالص شد. پروتئين هدف با وزن KDa61 ازطريق SDS-PAGEو متعاقب آن ايمونوبلاتينگ ارزيابي شد. مشاهده بيان پروتئين با وزن ملكولي قابل انتظار در SDS-PAGE و واكنش مثبت اين پروتئين با سرم موش ايمن شده با پروتئين MBP در ايمونوبلات نشان دهنده بيان موفق اين قطعه از پروتئين در باكتري اشيرشياكلي بود.

Septicemia viral disease (VHS) is one of the most important diseases of fish that has recently been developed in Iran and has caused severe damage to breeders. In order to identify the possible cause of the losses, farmed fish were sampled from epicenter where massive mortalities and economic losses had been occurred. Samples were collected from relevant tissues (i.e. liver, kidney, spleen, heart, and brain) of rainbow trout with clinical signs of VHS disease. The samples were stored in 70% ethanol, to perform RT-PCR. Then, recombinant plasmids were tested for protein expression in E. coli Rosetta strain. SDS-PAGE analysis indicated the production of a recombinant protein with an expected molecular weight of 61KDa. Thereafter, the recombinant protein was purified by amylose resin and its antigenicity was accessed by immunoblotting using a mouse polyclonal serum prepared against MBP protein. Positive reaction of the expressed protein with anti-MBP protein indicated that the expressed N protein possess antigenic epitopes and could be applied in future immunological studies.