خالص سازي آنزيم پلي گالاكتوروناز جدايه (IKO6) قارچAscochyta rabiei : عامل بيماري برق زدگي در نخود

Purification and Partial Characterization of Polygalacturonase From Virulent Isolate Of Ascochyta rabiei (IK06): Causal Agent of Ascochyta Blight in Chickpea

بيماري برق زدگي (Ascochyta blight) در نخود (Cicer arientinum) يكي از مهم‌ترين بيماري‌هاي اين گياه مي‌باشد كه توسط قارچ Ascochyta rabiei ايجاد مي‌گردد و خسارات زيادي را به اين محصول وارد ميسازد. آنزيم پلي گالاكتوروناز يكي از عوامل مهم در بيماريزايي اين قارچ محسوب مي‌شود كه با تخريب تركيبات ساختماني ديواره سلولي گياه باعث سست شدن و نفوذ پذيرشدن آن نسبت به پاتوژن مي‌گردد. در اين تحقيق جهت بررسي خصوصيات آنزيم پلي گالاكتوروناز توليد شده توسط جدايه IK06 قارچ A. rabiei اقدام به خالص سازي اين آنزيم با استفاده از ستون تعويض يوني بر روي بستر (Carboxy Methyl Sepharose) گرديد. مناسب‌ترين pH جهت اتصال آنزيم مذكور به بستر ستون برابر 5/5 تعيين گرديد. پس از اتصال پروتئين، شستشوي ستون و اعمال شيب غلظت نمك NaCl يك مولار، نتايج نشان داد در فراكسيون‌هاي 81 تا 96 در ناحيه غلظت نمكي بين 0/3 تا 0/4 مولار يك قله فعاليت آنزيمي مشاهده مي‌گردد. پس از رسوب دهي پروتئين‌هاي فراكسيون‌هاي فوق و با استفاده از SDS-PAGE يك باند پروتئيني با جرم ملكولي حدود 27 كيلودالتون به‌دست آمد. مطالعه زايموگرام مربوط به اين باند پروتئيني نشان داد كه اين پروتئين داراي فعاليت آنزيم پلي گالاكتورونازي مي‌باشد. بررسي pH مناسب براي فعاليت آنزيمي نشان داد كه پروتئين خالص شده، در pH برابر 7/5 بالاترين فعاليت آنزيمي را از خود نشان مي‌دهد.

Ascochyta blight caused by Ascochyta rabiei is one of the major diseases of chickpea (Cicer arientinum) in Iran. Many phytopathogenic microorganisms, incuding A .rabiei, attack their host plant by secreting pectic enzymes including polygalacturonase (PG) which causes modification of cell-wall structure, increasing accessibility of cell-wall components for degradation by other enzymes. Polygalacturonase is the major factor in the initiation of Ascochyta blight disease, therefore in this study, the enzyme was purified from a virulent isolate of A .rabiei (IK06). Fungi were cultured in PZ medium culture media were harvested and after dialysis used for purification. Purification was achieved by Carboxy Methyl Sepharose Fast Flow ion exchange column equilibrated to pH= 5.5. Zero to one molar NaCl gradient was used for elution of the proteins from the column. Determination of protein content and enzyme activity of each fraction showed that PG was eluted from the column in 0.3 to 0.4 M salt. The purity of the protein and the MW of the enzyme were determined using SDS-PAGE technique. The MW was found to be around 27 KDa. The activity of the purified protein was also evaluated using polyacrylamide gel containing pectin as substrate (zymogram gel). Optimum pH for the purified enzyme was 7.5.