جداسازي، همسانه سازي و خاموشي موقت ژن BBE1 با استفاده از تكنيك خاموشي ژن القا شده توسط ويروس (VIGS) در ژنوتيپ ايراني گياه شقايق .Papaver somniferum L

Isolation, cloning and transient silencing of BBE1 gene using virus induced gene silencing technique in Iranian genotypes of Papaver somniferum L.

گياه دارويي شقايق (.Papaver somniferum L) يكي از قديمي ترين گياهان دارويي جهان است و به عنوان تنها منبع تجاري براي توليد مسكن‌هاي مهم دارويي و مشتقات نيمه سنتزي مانند اكسي كدون و نالتركسون مطرح است. چندين آلكالوئيد بنزيل ايزوكوئينوليني ديگر با ويژگي‌هاي بالقوه دارويي از جمله پاپاورين، نوسكاپين و سانگوينارين نيز توسط اين گياه توليد مي‌شود. ژن BBE1 يكي از ژن‌هاي كليدي در بيوسنتز آلكالوئيدهاي بنزيل ايزوكوئينوليني در گياه شقايق بوده و اولين مرحله واكنش را در توليد آلكالوئيدهاي نوسكاپين و سانگوينارين كاتاليز مي‌كند. در اين پژوهش، ابتدا توالي كامل كد كننده ژن BBE1 با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي از گياه شقايق جداسازي شد. پس از جداسازي ژن مورد نظر، بخشي از آن به عنوان قطعه هدف خاموشي ژن انتخاب و سپس با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي در ناقل پلاسميدي pTZ57R/T همسانه سازي و مورد تعيين توالي قرار گرفت. در مرحله بعد اين قطعه خاموشي ژن BBE1 به ناقل‌هاي ويروس جغجغه‌اي توتون (pTRV) وارد و سازه‌هاي مختلف pTRV2-BBE1، pTRV2-Empty حاصل به همراه سازه كمكي pTRV1 بواسطه آگروباكتريوم به برگ‌هاي گياهان 3 تا 5 برگي تزريق و منتقل شد. نتايج جداسازي، وجود توالي 1608 جفت بازي را براي ژن BBE1 نشان داد. آناليز PCR با پرايمرهاي ژن CP وجود رونوشت‌هاي اين ژن را در گياهان تراريخت شده نشان داد. آناليز Real-time PCR ميزان خاموشي و كاهش 73 درصدي رونوشت‌هاي ژن BBE1 را در گياهان تراريخت در مقايسه با گياهان شاهد نشان داد.

The poppy (Papaver somniferum L.) is one of the oldest medicinal plant in the world. It remains the only commercial source for the important narcotic analgesics and semisynthetic derivatives such as oxycodone and naltrexone. Several other benzylisoquinoline alkaloids with potent pharmacological properties including papaverine, noscapine and sanguinarine also produce with this plant. BBE1 is one of key genes in biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids and catalyzes first step in production of noscapine and sanguinarine alkaloids. In the present study, the full length CDS of BBE1 gene was isolated from poppy plant using specific primers. Then, a specific fragment, corresponding to the BBE1 CDS was selected as silencing fragment and cloned into pTZ57R/T plasmid. In the next step, silencing fragment was cloned into pTRV plasmid and resulting constructs (pTRV2-BBE1 and pTRV2-Empty) along with helper plasmid (pTRV1) were transferred to Agrobacterium and infiltrated into young leaves. Result showed a 1608 bp DNA fragment for BBE1 gene. PCR analysis using CP specific primers showed presence of CP transcripts in the infiltrated plants. Real-time PCR analysis showed transcript reduction (about 73%) in the transgenic plant (infiltrated with pTRV2-BBE1) compared with control plants (infiltrated with pTRV2- Empty and non-infiltrated).