بررسي كشت سلول‌هاي بنيادي اسپرم ساز در شرايط چسبنده و غير چسبنده

Investigation of Spermatogonial Stem Cells in Adherent and Non- Adherent Culture

سلول‌هاي بنيادي اسپرم ساز سلول‌هايي هستند كه در غشاء پايه لوله هاي اسپرم ساز قرار گرفته و قادر به توليد اسپرم در طول حيات مردان مي باشند. مطالعات مختلف آزمايشگاهي نشان داد اين سلول‌ها بعد از جداسازي از بافت بيضه، تحت شرايط هاي خاص قادر به كشت هستند. در اين مطالعه سلول‌هاي بيضه موش هاي نر5-7 روزه نژاد NMRI پس از تيمار با آنزيم‌هاي هضم كننده كلاژناز تيپIV، DNAse و ديسپاز، جداسازي شدند. سپس تعداد تقريبي 106 سلول در محيط ‌هاي حاوي فاكتورهاي رشد با شرايط كشت چسبنده، روي فيبروبلاست جنيني موش و كشت غير چسبنده، روي آگارز 1 درصد، كشت داده شدند. نتايج نشان داد سلول‌هاي بيضوي كشت شده در شرايط غير چسبنده قادر به تشكيل كلني‌هايي بوده كه همانند كلني‌هاي سلول‌هاي بنيادي اسپرم ساز تشكيل شده در شرايط كشت چسبنده، ماركرهاي سلول‌هاي جنسي را بيان مي-كنند. مطالعه ميكروسكوپ الكتروني كلني‌ها نشان داد، هر دو نوع كلني همانند سلول‌هاي اسپرم ساز واقع در غشاء پايه لوله‌هاي اسپرم ساز داراي هسته بزرگ اما سيتوپلاسم كوچك مي‌باشند. رنگ‌آميزي ايمونوفلورسانس وجود كلني‌هاي β1-Integrin، α6-Integrin و Oct4 مثبت را تاييد كرد. آناليزهاي Real-time PCR نيز تفاوت معني‌داري در بيان ژن‌هاي سلول‌هاي جنسي اين كلني‌ها با سلول سوماتيكي نشان داد. از طرف ديگر افزايش بيان Ki67 در هر دو نوع كلني با استفاده از بررسي ايمونو سيتوشيمي مشاهده شد كه بيانگر خاصيت تكثيرپذيري اين قبيل از سلول-ها است. اين نتايج نشان مي‌دهد سيستم كشت غير چسبنده مي‌تواند بعنوان يك روش جديد براي كشت كوتاه مدت سلول‌هاي جنسي مشتق شده از بيضه مورد توجه محققين در تحقيقات بعدي قرار گيرد.

Spermatogonial stem cells are the undifferentiated cells in the basal membrane of the seminiferous tubules and are able to produce sperm in male testis. Different experimental studies proved the capatility of undifferentiated spermatogonial stem cells to culture under different conditions, after isolation of the testes. In this study mouse neonate testicular cells (5-7 days-old NMRI strain) isolated by digestive enzymes include Collagenase IV, Dispase and DNAse. Then, approximately 106 cells were cultured in both adherent on MEF feeder layer and non-adherent culture system on 1% agarose with condition mediums that contained growth factors. Studies demonstrates that testicular cells cultured in a non-adherent condition (non-adherent colonies) were able to form colonies similar to spermatogonial stem cell colonies in adherent condition (adherent colonies) and clearly expressed germ cell marker. Electron microscope analyses made evident that both types of colonies were similar to localized spermatogonial stem cells on the basement membrane of seminiferous tubules and showed a high nucleus/cytoplasm ratio. Immunocytochemistry assays proved that both of colony expressed germ cell markers β1-Integrin, α6-Integrin and Oct4 positive. Realtime PCR analysis revealed significant differences in the expression of germ cell genes Oct4, Sox-2, CD9 and EPCAM, between these colonies and somatic cells. On the other hand, high expression of Ki67 in these colonies showed that these cells have proliferative characteristics. These results proved that a non-adherent culture system similar to adherent culture could provide a favorable method for in vitro short-term culture of spermatogonial stem-like cell colonies.