جداسازي، شناسايي و بررسي ساختار ژن دفنسين (Def1) تربچه خوراكي (Raphanus sativus)

Isolation, identification and study of defensin gene structure (Def1) in Raphanus sativus

امروزه مطالعات نشان داده است كه گياهان، با توليد پپتيدهاي ضد قارچي به نام دفنسين ها، سبب ايجاد منافذي درغشاء سلولي قارچ مهاجم و در نتيجه خروج تركيبات سلولي به بيرون از غشاء، تغيير در پتانسيل غشاء و نهايتاً مرگ سلولي را منجر مي شوند. هدف اين تحقيق جداسازي، شناسايي و بررسي ساختار ژن Def1 تربچه خوراكي (Raphanus sativus) با كلون كردن و تعيين توالي آن است. براي اين منظور پس از استخراج DNA ژنومي به روش CTAB، تكثير اين ژن با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي RDeff و RDefr انجام شد. قطعه تكثير شده به طول تقريبي 356 جفت باز در ناقل pJET1.2 كلون شد. سازه به دست آمده با استفاده ازالگوهاي هضم آنزيمي و PCR تأييد شد. همچنين cDNA اين ژن، كه به طول تقريبي 243 جفت باز بود، پس از استخراج RNA با استفاده ازآغازگرهاي اختصاصي فوق سنتز گرديد. قطعه تكثيرشده از cDNA پس از تأييد در ناقل pJET1.2 كلون و تعيين توالي گرديد. مقايسه توالي DNA ژنومي و cDNA اين ژن نشان داد كه ژن Def1 گياه تربچه حاوي يك اينترون به طول 113 جفت باز بوده و open reading frame آن يك پپتيد به طول 80 اسيد آمينه را كد مي كند. مقايسه توالي پپتيد بدست آمده از ژن Def1 از گياه تربچه با توالي هاي ثبت شده مرتبط در بانك ژني مشابهتي بين 90 تا 98/8 درصد را نشان داد. شناسايي و همسانه سازي اين ژن مي تواند در آينده در راستاي مديريت كنترل و مبارزه با بيماري هاي قارچي مورد استفاده قرار گيرند.

Different studies have demonstrated that the plants, by producing antifungal peptides, such as defencins, cause the pores in the fungal plasma membrane which leads to efflux and influx of cellular components. These changes ultimately lead to fungal cell death.The purpose of this research was to isolate, identify, and study of defencin gene structure in Raphanus sativus by cloning and sequencing. The genomic DNA extraction from Raphanus sativus was achieved by CTAB method. Amplification of this gene was performed using the specific primers (RDeff /RDefr). The amplified DNA fragment (356bp) was cloned into pJET1.2 cloning vector and the constructs were confirmed via enzyme digestion and PCR patterns. Also, the cDNA of this gene, which was about 243bp, was synthesized after extraction of RNA by specific primers. The amplified fragment of the cDNA was confirmed, cloned in the pJET1.2 vector and sequenced. Comparison of genomic DNA and cDNA sequences showed that Def1gene contains one intron (113bp) and its open reading frame encodes a peptide with a length of 80 amino acids. Alignment of the amino acid sequence of Def1 shows 90 to 98.8% homology with other reported defensin sequences. The identification and cloning of this gene could be used in future for fungal diseases management.