عنوان مقاله :
محلول‌سازي و تخليص بهينه پروتئين نوتركيب امتزاجي تريپاراتيد بيان‌شده در اشريشيا كلي
عنوان به زبان ديگر :
Optimized Solubilization and Purification of Recombinant Teriparatide Fusion Protein Expressed in E. coli
پديد آورندگان :
عباس زاده، سپيده سازمان پژوهشهاي علمي و صنعتي ايران، تهران - پژوهشكده زيست فناوري , بختياري، ناهيد سازمان پژوهشهاي علمي و صنعتي ايران، تهران - پژوهشكده زيست فناوري , اميني بيات، زهرا سازمان پژوهشهاي علمي و صنعتي ايران، تهران - پژوهشكده زيست فناوري
كليدواژه :
تخريب سلولي , اشريشيا كلي , تخليص , پروتئين امتزاجي نوتركيب تريپاراتيد
چكيده فارسي :
اهداف: روش‌هاي تخريب سلولي مختلفي براي استخراج پروتئين‌هاي داخل سيتوپلاسمي وجود دارد. هدف مطالعه حاضر انتخاب بهترين روش استخراج پروتئين امتزاجي نوتركيب تريپاراتيد از ميزبان باكتريايي اشريشيا كلي و دستيابي به بهترين شرايط تخليص آن بود.
مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربي حاضر، سلول‌هاي باكتري با روش‌هاي سونيكاسيون با دورهاي متفاوت، له‌كردن در نيتروژن مايع، هموژناسيون تحت دو فشار مختلف و روش شيميايي شكسته شدند. نمونه‌هاي مربوط به رسوب و محلول رويي حاصل از هر روش، در ژل سديم‌دودسيل‌سولفات الكتروفورز شدند. سلول‌هاي شكسته‌شده در محيط كشت لوريا برتاني جامد كشت و به‌روش گرم رنگ‌آميزي شدند. كروماتوگرافي تمايلي نيكل براي خالص‌سازي پروتئين در شرايط واسرشته و غيرواسرشته به‌ترتيب با شيب pH و غلظت ايميدازول به كار رفت. تمامي نمونه‌ها روي ژل سديم‌دودسيل‌سولفات- پلي‌اكريل‌آميد برده شدند و محاسبه ميزان پروتئين تخليص‌شده با آزمون ميكروبرادفورد صورت گرفت.
يافته‌ها: در دورهاي 20 و 25دور در دقيقه بخش زيادي از پروتئين امتزاجي وارد بخش محلول شد. در روش له‌كردن در نيتروژن مايع، پروتئين‌ها بيشتر وارد بخش رسوب شدند. تخريب سلول‌ها در روش شيميايي كامل بود. شكستن سلول‌ها با هموژناسيون تحت فشار 50بار، بيشتر از 15بار بود. در تخريب شيميايي همراه با سونيكاسيون مقدار بسيار زيادي از پروتئين امتزاجي وارد بخش محلول شد. در شرايط غيرواسرشته هيچ پروتئين امتزاجي نوتركيبي با بافر جداسازي از ستون خارج نشد، اما در شرايط واسرشته مقدار زيادي از پروتئين تخليص شد.
نتيجه‌گيري: در تخريب شيميايي همراه با سونيكاسيون، 7/97% پروتئين كل به بخش محلول وارد مي‌شود و تخليص در شرايط واسرشته برخلاف شرايط غيرواسرشته به‌طور مناسب و مطلوب صورت مي‌گيرد.
چكيده لاتين :
Aims There are several cell disruption methods for intracellular protein extraction. The aim
of this study was to select the best approach for recombinant teriparatide fusion protein
extraction from E. coli and achieve the best purification conditions.
Materials & Methods In this experimental research, bacterial cells were disrupted by different
methods such as sonication in different cycles, grinding with liquid nitrogen in two different
cell culture volumes, and homogenization at two different pressures. The supernatant and
pellet samples were run on sodium dodecyl sulphate gel. All the cell lysates were cultured on
LB agar medium and stained with Gram staining method. The Ni2+ affinity chromatography
of recombinant teriparatide fusion protein was done under denaturing and non-denaturing
conditions, using pH and imidazole concentration gradient, respectively. All samples were
taken on sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel and the amount of purified protein was
calculated by Micro-Bradford assay.
Findings In the 20 and 25 cycles, a large part of the fusion protein led to protein solubilization.
In the method of grinding with liquid nitrogen, proteins were more likely to enter the sediment
part. The cell disruption was complete in a chemical method. The cell disruption under 50bar
homogenization was more than that of 15bar. In chemical degradation and sonication, a
large amount of fusion protein led to protein solubilization. In non-denaturing conditions, no
recombinant fusion protein was removed from the column with the isolation buffer, but in the
denaturing conditions, a large amount of proteins was purified.
Conclusion The combined method of chemical degradation and sonication leads to
approximately 97.7% of protein solubilization, and the purification in denaturing condition
has also the suitable result in contrast to non-denaturing condition.
عنوان نشريه :
زيست فناوري دانشگاه تربيت مدرس
عنوان نشريه :
زيست فناوري دانشگاه تربيت مدرس
