بيان ترشحي كلسيتونين نوتركيب انساني در ريزجلبك سبز كلاميدوموناس رينهاردتي

Secretory Expression of Recombinant Human Calcitonin in Green Microalgae Chlamydomonas reinhardtii

كلسيتونين هورمون پپتيدي كوچكي است كه در انسان توسط سلول‌هاي پارافوليكولار تيروئيد توليد شده و تنظيم‌كننده متابوليسم كلسيم و فسفر است. كاربرد دارويي كلسيتونين در درمان ناهنجاري‌هاي مربوط به كلسيم و پوكي استخوان است. به‌علت وزن مولكولي پايين و ناپايداري آن، توليد نوتركيب كلسيتونين با مشكلات زيادي همراه بوده و همچنين توليد در سيستم پروكاريوتي به تيمارهاي بعدي براي دستيابي به مولكول بالغ نياز دارد. اخيراً به توانايي ريزجلبك‌ها در بيان پروتئين‌هاي نوتركيب توجه زيادي جلب شده است. لذا هدف اين تحقيق، مطالعه توانايي Chlamydomonas Reinhardtii در توليد ترشحي كلسيتونين انساني نوتركيب بود. مواد و روش‌ها: توالي كدكننده كلسيتونين بهينه‌سازي‌شده به‌همراه توالي راهبر ترشحي كربونيك‌انيدراز در وكتورهاي Pchlamy_3 وPchlamy_4 كلون شد. پلاسميدهاي نوتركيب به سويه وحشي و سويه واجد ديواره ناقص Chlamydomonas Reinhardtii با روش الكتروپوريشن منتقل شدند. سويه‌هاي نوتركيب با روش كلني واكنش زنجيره‌اي پليمراز غربالگري شده و سويه‌هاي منتخب براي توليد كلسيتونين كشت داده شدند. پس از رشد سويه‌ها، محيط كشت جمع‌آوري شده و با روش الايزا مورد ارزيابي قرار گرفت. يافته‌ها: وكتور Pchlamy_3 از قابليت مناسبي براي بيان توالي هدف برخوردار نبوده و سويه‌هاي نوتركيب همگي با استفاده از وكتور Pchlamy_4 حاصل شدند. همچنين سويه وحشي نيز كارآيي مناسبي جهت نوتركيبي نداشته و نوتركيبي فقط در سويه واجد ديواره ناقص ديده شد. ميزان كلسيتونين توليدي در سويه مثبت به‌صورت تقريبي يك پيكوگرم بر ميلي‌ليتر محاسبه شد. نتيجه‌گيري: نتايج اين مطالعه نشان مي‌دهند كه راهبرد به‌كاررفته براي توليد ترشحي كلسيتونين نوتركيب موفقيت‌آميز بوده و براي مطالعات بعدي قابل استفاده است.

Aims Calcitonin is a small peptide hormone that is produced by parafollicular thyroid cells in human and regulates the metabolism of calcium and phosphorus. It is therapeutically used in treatment of calcium-related disorders and osteoporosis. Recombinant calcitonin production encounters with several difficulties due to instability and low molecular weight, and also needs further treatment in prokaryotic systems. Microalgae have recently garnered high attention for their potential in expression of recombinant proteins. The aim of present study was to assess the ability of Chlamydomonas Reinhardtii to express recombinant human calcitonin. Materials & Methods The optimized calcitonin coding sequence and carbonic anhydrase secretory signal was cloned in Pchlamy¬_3 and Pchlamy_4 vectors. The recombinant plasmids were transformed to wild type and also a cell wall deficient strain of Chlamydomonas Reinhardtii by electroporation. Transformed strains were screened by colony PCR method and selected strains were cultivated to produce recombinant calcitonin. Culture media have been collected after cells growth and assayed by ELISA method. Findings Pchlamy_3 vector could not express the target sequence as desired and all the recombinant strains were resulted from Pchlamy_4 vector. The wild type strain also did not show desired yield and only cell wall deficient strain was successfully transformed. The yield of recombinant calcitonin produced by positive strain was about 1 pg/ml. Conclusion The results of this study show that the used strategy for secretory production of recombinant calcitonin was successful and it could be used in further studies.