كلونينگ ژن Tpel كلستريديوم پرفرينجنز در باكتري اشريشيا كلي

Cloning of Tpel Gene of Clostridium perfringens in E. coli

توكسين Tpel كلستريديوم پرفرينجنز با فعاليت سيتوتوكسيتي در تيپ‌هاي A، B و C در سال‌هاي اخير شناسايي شده است. ﺑﺎﻛﺘﺮي كلستريديوم پرفرينجنز ﺣﺪاﻗﻞ 15 ﻧﻮع ﺗﻮﻛﺴﻴﻦ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺗﻮﻟﻴﺪ ميﻛﻨﺪ ﻛﻪ در ﺑﻴﻤﺎري‌زايي آن ﻧﻘﺶ دارﻧﺪ. ﺑﺮاﺳﺎس ﺗﻮﻟﻴﺪ ﭼﻬﺎر ﺗﻮﻛﺴﻴﻦ ﻣﻬﻢ و اصلي آﻟﻔﺎ، ﺑﺘﺎ، اﭘﺴﻴﻠﻮن و ﻳﻮﺗﺎ در ﭘﻨﺞ ﮔﺮوه A، B، C، D و E قرار داده ﺷﺪه اﺳﺖ. در اين تحقيق از كلستريديوم پرفرينجنز تيپ B استفاده شد. توكسين Tpel موجب ايجاد بيماري‌هاي روده‌اي به‌ويژه عفونت‌هاي روده‌اي در انسان و بيماري آنتريت‌نكروتيك طيور مي‌شود. در اين مطالعه DNA ژنومي كامل به روش فنل- كلروفرم استخراج و از روش واكنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR) براي جداسازي ژن Tpel به‌وسيله يك جفت پرايمر اختصاصي از DNA ژنومي كامل باكتري استفاده شد. محصول PCR پس از اتصال به وكتور pTZ57RL/T به روش TA-كلونينگ در باكتري اشريشيا كلي (E. coli) سويه TOP10 مستعد كلون شد و سپس روش PCR كلوني براي غربالگري كلوني‌هاي باكتري ترانسفورم‌شده با پلاسميد نوتركيب به كار رفت. وجود قطعه مورد نظر روي ژل آگارز 1٪ نشان داد كه ژن Tpel در اشريشيا كلي سويه TOP10 كلون شده است.

Clostridium perfrinjens is an anaerobics, Gram-positive, rod-shaped and heat resistant bacterium of genus clostridium. C. perfringens is a spore-forming bacterium and widely occurring pathogen. The organism is grouped into 5 types (A, B, C, D, and E) on the basis of the production of 4 major toxins alpha, beta, epsilon, and iota toxins. Tpel Clostridium perfringens (C. perfringens) toxin have identified with A, B, and C types by cytotoxin activity in recent years. In this study C. perfringens type B had been used. Tpel caused to intestinal disease especially intestinal infections in human and necrotic enteritis in birds. In this study, perfect genomic DNA extracted by phenol-chloroform and Polymerase Chain Reaction (PCR) method used to isolation Tpel gene by a couple exclusive primer of perfect bacterium genomic DNA. PCR product after joining to pTZ57RL/T vector by TA cloning method in E. coli strain TOP10 susceptible became cloned and then colony PCR method used to screening transforming bacterium colonies with recombinant plasmid. Presence of fragment close to 2469bp on 1% agarose gel indicated that Tpel gene in E. coli strain TOP10 have be cloned.