بررسي مقاومت به حلال‌هاي آلي در پروتئاز قليايي برون‌سلولي حاصل از Brevibacillus borstelensis AMN جداشده از چشمه آب گرم ايران

Investigation of Organic Solvents-Resistant Extracellular Alkaline Protease from Brevibacillus borstelensis AMN Isolated from Hot Spring of Iran

پروتئازهاي مقاوم به حلال‌هاي آلي بيش از دو دهه است كه به ميزان زيادي مورد توجه قرار گرفته است. پروتئازها قادر به كاتاليز واكنش‌ها در محيط‌هاي آلي هستند، به همين دليل پايداري آنزيم در حضور حلال‌هاي آلي حائز اهميت است. در اين پژوهش از آب چشمه قينرجه در ايران باكتري جداسازي شد كه قادر به توليد پروتئاز مقاوم به حلال‌هاي آلي است. غربالگري سويه مولد پروتئاز از طريق كشت در محيط اسكيم‌ميلك آگار و سنجش قطر هاله انجام شد. سنجش فعاليت آنزيمي به روش هيدروليز كازئين به‌عنوان سوبسترا صورت گرفت. باكتري كه داراي بيشترين فعاليت پروتئازي بود براساس توالي‌يابي 16S rDNA، ويژگي‌هاي مورفولوژيكي و بيوشيميايي شناسايي شد. اثر حلال‌هاي آلي، دما، pH و سديم‌كلريد بر فعاليت پروتئازي مورد سنجش قرار گرفت. سويه جداسازي‌شده با مطالعه نتايج حاصل از تعيين توالي، خصوصيات مورفولوژيكي و بيوشيميايي به‌عنوان سويه جديدي از Brevibacillus borstelensis شناسايي شد كه قادر به توليد پروتئاز برون‌سلولي مقاوم به حلال‌هاي آلي با فعاليت آنزيمي 0/53واحد بر ميلي‌ليتر است. پروتئاز توليدشده پس از 2ساعت انكوباسيون در °C30، در طيف وسيعي از حلال‌هاي آلي قادر به فعاليت بود و بيشترين فعاليت پروتئوليتيك آن در حضور 25% ايزوپروپانول مشاهده شد. بررسي ويژگي‌هاي بيوشيميايي آنزيم نشان داد كه پروتئاز توليدشده در pH برابر 9 و دماي ˚C60 بيشترين فعاليت را داشته است. نتايج حاضر نشان داد كه پروتئاز جداسازي‌شده داراي ويژگي‌هاي برجسته‌اي مانند فعاليت و پايداري نسبت به شرايط قليايي و حلال‌هاي آلي است كه براي استفاده در صنايع بيوتكنولوژي مختلف كاربرد دارد.

The Stability of protease in organic solvent media has been widely discussed for more than two decades. Proteases can catalyze synthetic reactions in organic media, by this way solvent stabilities of proteases are very important. In this study, we reported a bacterium isolated from hot spring of Geinarje, Iran producing an organic solvent stable protease. Protease producing bacteria were screened on skim milk agar and the formation of a clear zone around the bacterial colony was investigated. Proteolytic activity was assayed by a modified caseinolytic method using casein as a substrate. The best alkaline protease producing bacterium was selected and identified on the basis of 16S rDNA gene sequencing and morphological and biochemical characteristics. The effect of organic solvents, temperature, pH, and NaCl on proteolytic activity were examined. According to phylogenetic analysis, morphological and physiological tests, isolated, the bacterium was identified as a new strain of Brevibacillus borstelensis. This strain was able to produce an extracellular organic solvent-stable protease with 0.53U/ml enzyme activity. After 2 hour incubation at 30°C the protease of Brevibacillus borstelensis AMN was active in wide ranges of organic solvents, and its activity was enhanced in the presence of 25% (V/V) isopropanol. The biochemical properties of the enzyme revealed that the optimal pH and temperature for protease activity were 9.0 and 60°C, respectively. Our finding indicated that these robust properties of protease, like outstanding activity and stability in organic solvents and alkaline medium, might be applicable for various industrial biotechnologies.