بيان، تخليص و تعيين خصوصيات دومين متصل‌شونده به ip3 نوع 2 انساني

Expression, Purification, and Characterization of IP3-binding Domain from Human Type 2

اهداف: ip3 يك مولكول كليدي تنظيم كننده در مسير انتقال پيام است و با اتصال به گيرنده هاي درون سلولي ip3r روي سطح ذخاير كلسيم داخل سلولي باعث آزادسازي كلسيم به درون سيتوپلاسم مي شود. هدف اين پژوهش، بيان، تخليص و تعيين خصوصيات دومين متصل شونده به ip3 )ip3bd:1-604 aa( نوع 2 انساني بود.مواد و روش ها: در پژوهش تجربي حاضر، پلاسميد pet28a حامل ژن ip3bd با روش شيميايي به داخل باكتري هاي بياني e.coli سويه bl21) de3( منتقل شد. براي بهينه سازي بيان در سيستم باكتريايي، بيان در شرايط مختلف مورد بررسي قرار گرفت و دماهاي بيان مختلف از جمله 16، 18، 20 و c24 °، زمان هاي مختلف بعد از القا، نوع القاكننده و غلظت هاي مختلف آن بررسي شد. باكتري هاي القاشده براساس شوك حرارتي از طريق كروماتوگرافي تمايلي ستون نيكل سفارز تخليص و ميزان خلوص پروتئين از طريق sds-page بررسي شد. نشر فلورسانس دومين متصل شونده به ip3 در حضور و عدم حضور ليگاند ip3 در طول موج 295نانومتر اندازه گيري شد.يافته ها: پروتئين در محيط هاي lb و tb و 2xyt بيان قابل توجهي نداشت و در زمان هاي مختلف تغييري در آن مشاهده نشد. بيان پروتئين باكتري در دماي c20 ° براساس شوك حرارتي c42° نسبت به تمام حالات بيشتر بود. تخليص باكتري هاي القاشده براساس شوك حرارتي به سختي تكرار مي شد و نمونه هاي خالص شده نيز غلظت بالايي نداشتند. نشر فلورسانس پروتئين در حضور ليگاند ip3 كاهش يافت.نتيجه گيري: بيان باكتريايي دومين متصل شونده به ip3 از گيرنده نوع 2 گونه انساني ضعيف است، ولي با القاي شوك c42° بيان پروتئين تا حدود نسبتاً زيادي افزايش مي يابد.

Aims IP3 is a key regulator molecule in the message transmission pathway, and releases calcium into the cytoplasm by binding intracellular IP3R receptors on the surface of the internal calcium stores. The aim of this study was expression, purification, and characterization of IP3- binding domain from human type 2. Materials & Methods In this experimental study, the pET-28a plasmid of the carrier of the IP3BD gene was transferred to the E.coli expression strain BL21 (DE3) by chemical method. In order to optimize the expression in the bacterial system, the expression was studied in different conditions, and various temperatures such as 16, 18, 20, and 24°C, the different times after incubation, type of inducer, and its different concentrations were investigated. The induced bacteria were purified on the basis of thermal shock through nickel column for chromatography and the purity of the protein was measured through SDS-PAGE. The fluorescence emission of IP3-binding domain was measured in the presence and absence of an IP3 ligand at wavelength of 295nm. Findings Protein did not have a significant expression in LB, TB, and 2xYT environments, and no changes were observed at different times. Expression of bacterial protein at 20°C based on thermal shock of 42°C was higher than in all cases. The purification of the induced bacteria was difficultly repeated due to thermal shock, and the purified samples did not have high concentrations. The fluorescence emission of the protein decreased in the presence of the IP3 ligand. Conclusion The bacterial expression of IP3-binding domain from human type 2 is weak, but the expression of protein increases with the induction of shock of 42°C.