مقايسه پايداري ترموديناميك و بازتاخوردگي سينتيك آنزيم لوسيفراز گونه ايراني و برخي جهش‌يافته‌هاي آن

Comparison of Thermodynamic Stability and Kinetic Refolding of Lampyris turkestanicus and Some of Its Mutants

اهداف: احتمال برقراري ميان كنش هاي الكتروستاتيك به علت فراواني رزيدوهاي باردار آب دوست به ويژه آرژنين به عنوان مهم ترين فاكتور پايداركننده دمايي آنزيم هاي گرمادوست مطرح شده است. هدف اين مطالعه، مقايسه پايداري ترموديناميك و بازتاخوردگي سينتيك آنزيم لوسيفراز گونه ايراني و برخي جهش يافته هاي آن بود.مواد و روش ها: در مطالعه تجربي حاضر، پايداري گرمايي و نحوه بازتاخوردگي آنزيم لوسيفراز گونه ايراني لامفيريس تركستانيكوس و 3 جهش يافته err, err/i232r, err/q35r/i182r/i232r توسط تكنيك هاي مختلف اسپكتروسكوپي بررسي شد. به منظور بيان بالاي پروتئين ها يك تك كلوني از هر يك از نمونه ها انتخاب و به 10ميلي ليتر محيط كشت lb داراي كانامايسين با غلظت 50ميكروگرم بر ميلي گرم تلقيح و در دماي c deg; 37 و با هوادهي مطلوب به مدت 1512 ساعت انكوبه شد. به منظور تهيه محتواي سلولي از باكتري ها، محيط كشت القاشده به مدت 5 دقيقه در 5000گرم و دماي c deg; 4 سانتريفوژ شد. نتايج از طريق مطالعات با روش هاي طيف سنجي دورنگ نمايي دوراني در ناحيه دور، نزديك و فلورسانس ذاتي، مطالعات كالريمتري روبشي تفاضلي (dsc) و آزمايش هاي سينتيكي با استفاده از تكنيك جريان متوقف مبتني بر فلوئورسانس به دست آمد.يافته ها: همراه با افزايش تعداد رزيدوي آرژنين در سطح پروتئين، پايداري و فشردگي ساختاري آنزيم هاي جهش يافته در مقايسه با آنزيم وحشي افزايش يافته و ترموگرام هاي حاصل از مطالعات كالريمتري روبشي تفاضلي نيز بيانگر افزايش اندكي در tm و آنتالپي كالريمتري پروتئين هاي جهش يافته نسبت به پروتئين وحشي بودند.نتيجه گيري: ثابت سرعت بازتاخوردگي آنزيم هاي جهش يافته نسبت به نوع وحشي افزايش پيدا كرده است. بهبود پارامترهاي ترموديناميك و سينتيك ناشي از بهبود ميان كنش هاي الكترواستاتيك است كه منجر به درجه بالاتري از فشردگي و تراكم ساختاري مي شود.

Aims The probability of establishing electrostatic interactions due to the abundance of charged hydrophilic residues and especially arginine is considered the most important thermal stabilizing factor of thermophilic enzymes. The current study was conducted with the aim of comparing thermodynamic stability and kinetic refolding of Lampyris turkestanicus and some of its mutants. Materials & Methods In the present experimental thermal stability and the way of refolding Lampyris turkestanicus and 3 mutations, including ERR, ERR/I232R, ERR/Q35R/I182R/I232R were investigated by various spectroscopic techniques. In order to high expression of proteins, a single clone of each sample was selected and inoculated into 10ml of LB culture medium, containing Kanamycin at a concentration of 50μg/mg and incubated at 37°C with an ideal aeration for 12-15 hours. The culture medium was centrifuged for 5 minutes at 5000g at 4°C to provide the cellular contents of the bacteria. The results were obtained through spectroscopic methods of remote and near circular dichroism, intrinsic fluorescence, differential scanning calorimetry, and kinetics experiments, using fluorescence-stopped flow technique. Findings Along with the increase in the number of arginine residues at the protein level, the stability and structural compression of the mutated enzymes in comparison with the wild enzyme were increased and the thermograms obtained from differential scanning calorimetry showed a slight increase in Tm and calorimetric enthalpy of mutated proteins in comparison with wild protein. carotenoids (11.65 and 2.67 mg/g, respectively). Conclusion The rate constant of refolding mutated enzymes has increased compared with the wild type. The improvement of thermodynamic and kinetic parameters results from the improvement of electrostatic interactions, which results in a higher degree of compression and structural density.