شناسايي مولكولي و بهينه‌سازي توليد آنزيم پروتئاز قليايي خارج سلولي باكتري باسيلوس پسودوفيرموس msb22 با استفاده از روش‌شناسي سطح پاسخ

Molecular Detection and Optimization of Extracellular Alkaline Protease Production of Bacillus pseudofirmus MSB22 Using Response Surface Methodology

اهداف: پروتئازهاي قليايي يكي از مهم ترين گروه از آنزيم هاي صنعتي هستند و كاربردهاي فراواني دارند. هدف مطالعه حاضر يافتن پارامترهاي فيزيكوشيميايي موثر بر توليد آنزيم پروتئاز قليايي توليدشده توسط باكتري باسيلوس پسودوفيرموس msb22 به وسيله روش تك عاملي (ofat) و سپس بهينه سازي توليد اين آنزيم با روش سطح پاسخ در قالب طرح مركب مركزي چرخش پذير بود.مواد و روش ها: در مطالعه تجربي حاضر جداسازي ميكروارگانيزم توليدكننده پروتئاز قليايي از نمونه هاي پساب كارخانه هاي سوسيس و كالباس اصفهان انجام شد. خصوصيات موفولوژيكي و بيوشيميايي سويه طبق كتاب برگي و به وسيله تكثير توالي ژن 16s rrna صورت پذيرفت. تشخيص ژن متالوپروتئاز و سرين پروتئاز قليايي با واكنش واكنش زنجيره اي پلي مراز (pcr) و سنجش فعاليت آنزيم با معرف فولين انجام شد. غربالگري متغيرهاي موثر در توليد آنزيم با روش تك عاملي و بهينه سازي توليد با روش سطح پاسخ و بررسي آماري صورت گرفت. نرم افزار mega 6 براي آناليزهاي فيلوژنتيكي به كار رفت. به منظور تحليل داده ها نرم افزار design expert 7 و آزمون تحليل واريانس يك طرفه به كار رفتند.يافته ها: حداكثر توليد پروتئاز كه به ترتيب 85/1برابر و 3/45 برابر بيشتر از مقدار توليدشده حاصل بهينه سازي روش تك عاملي و شرايط غيربهينه بود، با استفاده از 1% قند زايلوز، 3% عصاره گوشت، 4% مايه تلقيح باكتريايي، در ph برابر 10 و دماي 30درجه سانتي گراد به دست آمد. مدل درجه دوم به دليل بالابودن مقدار ضريب تشخيص پيش بيني، توانايي زيادي در پيش بيني داده هاي جديد داشت.نتيجه گيري: روش تك عاملي و سطح پاسخ به ترتيب در غربالگري متغيرهاي موثر و بهينه سازي توليد آنزيم مفيد هستند و ژن هاي sub i و sub ii (ژن هاي سرين پروتئازهاي قليايي) در باسيلوس پسودوفيرموس msb22 وجود دارند.

Aims Alkaline protease is one of the most important groups of industrial enzymes with many applications. The aim of this study was to determine the physicochemical parameters affecting the production of alkaline protease enzyme produced by Bacillus pseudofirmus MSB22 by onefactor- at-a-time (OFAT) method and optimize the production of this enzyme by the response surface methodology (RSM) in the form of a rotatable central composite design. Materials & Methods In the present experimental study, the isolation of microorganism producing alkaline protease from wastewater from sausage and lunch meat factories in Isfahan was carried out. The morphological and biochemical characteristics of the strain were performed according to the Bergey’s book and amplification of 16S rRNA gene sequences. Detection of metalloproteinase gene and alkaline serine protease was done by polymerase chain reaction (PCR) reaction and enzyme activity measurement was performed by Folin reagent. Screening of variables effective in enzyme production was done, using the one-factorat- a-time method and optimization was performed by response surface methodology. MEGA 6 software was used for phylogenetic analyses. To analyze the data, the Design Expert 7 software and the one-way analysis of variance were used. Findings The maximum protease production, which was 1.85 times higher than that of OFAT method and 3.45 times higher than unoptimized conditions was obtained, using 1% w/v xylose, 3% w/v beef extract, 4% v/v inoculation size, pH 10, and 30°C. The established quadratic model had a great ability to predict responses to new observations due to a high value of the predicted determination coefficient. Conclusion OFAT and RSM strategies are useful screening and optimization methods, respectively and sub I and sub II genes (alkaline serine protease genes) are detected in Bacillus pseudofirmus MSB22.