بيان موقت فرم نوتركيب آنزيم اندونوكلئاز pars ii با روش آگرواينفيلتراسيون در گياه توتون

Transient Expression of Recombinant PARS II Endonuclease Enzyme Using Agroinfiltration in Tobacco

اهداف: توليد پروتئين هاي نوتركيب در گياهان تراريخته (زراعت مولكولي)، يكي از جنبه هاي كاربردي مهندسي ژنتيك محسوب مي شود. پروتئين هاي توليدشده توسط گياهان بر خلاف سيستم هاي توليد مبتني بر سلول هاي جانوري و باكتريايي به علت عدم وجود عوامل بيماري زاي مشترك انسان و دام، بسيار ايمن هستند و هزينه توليد پاييني دارند. هدف اين پژوهش، بيان موقت فرم نوتركيب آنزيم اندونوكلئاز pars ii با استفاده از روش آگرواينفيلتراسيون در گياه توتون بود.مواد و روش ها: در مطالعه تجربي حاضر، امكان توليد فرم نوتركيب اندونوكلئاز pars ii با استفاده از سيستم بيان موقت به واسطه آگروباكتريوم مورد بررسي قرار گرفت. سازه بياني pbi-pars (مبتني بر ناقل دوگانه pbi121) حاوي توالي كامل رمزكننده pars ii، توالي كوتاه كوزاك در بالادست و توالي رمزكننده هشت آمينواسيد هيستيدين در پايين دست ژن، ساخته و با روش آگرواينفلتراسيون به برگ هاي توتون (nicotiana tabacum) تزريق شد. پس از گذشت 72 ساعت، بيان ژن مورد نظر در نمونه هاي آگرواينفيلتره شده با واكنش rt-pcr و بلات نقطه اي با آنتي بادي ضدهيستيدين به ترتيب در سطح mrna و پروتئين انجام شد.يافته ها: صحت سازه بياني ساخته شده تاييد شد و نتايج بلات نقطه اي با آنتي بادي ضدهيستيدين، بيان پروتئين نوتركيب pars ii را مورد تاييد قرار داد، در حالي كه هيچ نشاني از بيان پروتئين نوتركيب در گياهان شاهد آگرواينفيلتره شده با سازه pbi121 مشاهده نشد. مقادير قابل توجهي از نوكلئاز نوتركيب pars ii در برگ هاي توتون توليد شد.نتيجه گيري: روش آگرواينفيلتراسيون يك روش موثر و كوتاه مدت براي توليد انبوه نوكلئاز خالص نوتركيب pars ii در گياه توتون است.

Aims The production of recombinant proteins in transgenic plants (molecular farming) is considered a functional aspect of genetic engineering. Unlike animal and bacterial cell-based production systems, proteins produced by plants are very safe and have low production costs due to the absence of common pathogens in humans and animals. The aim of this study was the transient expression of recombinant PARS II endonuclease enzyme using agroinfiltration in tobacco. Materials & Methods In this experimental study, the possibility of producing a recombinant form of PARS II endonuclease was investigated, using transient expression system via Agrobacterium. The pBI-Pars expression construct (based on the binary vector pBI121) containing the full sequence of the PARS II encoder, upstream kozak, and a downstream 8x-His tag sequence, was infiltrated into Nicotiana tabacum leaves with Agroinfiltration method. After 72 hours, the expression of PARS II gene in agroinfiltrated leave samples was confirmed through Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and protein Dot-blot, using Anti-His antibody at the levels of mRNA and protein, respectively. Findings The accuracy of the constructed expression construct was confirmed, and the results of Dot-blot by Anti-His antibody confirmed the expression of the recombinant PARS II protein, while no recombinant protein expression was observed in agroinfiltrated control plants with pBI121 construct. Significant amounts of recombinant PARS II nucleases were produced in tobacco leaves. Conclusion Agroinfiltration is an effective and short-term method for mass production of pure recombinant PARS II nucleases in tobacco.