بهينه سازي توالي ژن رنين گاوي و تهيه سازه ژني مناسب براي توليد كيموزين در مخمر Pichia pastoris

Optimization of calf rennin gene and construction of gene construct for the recombinant chymosin production in Pichia pastoris

كيموزين حيواني بـه عنـوان موثرترين آنزيم براي توليد پنير مطرح است كه اين امر به دليل كيفيت بسيار مناسب بافت و عطر و طعم پنير توليد شده مي‌باشد. با توجه به تقاضاي روز افزون نسبت به اين آنزيم نياز است در كنار ساير منابع گياهي و ميكروبي از منابع نوتركيب نيز براي توليد اين آنزيم استفاده گردد. در اين پژوهش به منظور توليد نوتركيب كيموزين، و نيز بهبود بيان ژن كيموزين گاوي در مخمر، ابتدا توالي ژن كيموزين بر اساس كاربرد كدوني (Codon usage) مخمر پيچيا پاستوريس بهينه‌سازي و سنتز گرديد. پس از بهينه‌سازي توالي نوكلئوتيدي، شاخص انطباق كدوني (CAI) از 59/0 به 72/0 افزايش پيدا كرد در حالي‌كه، توالي ژني 83% با توالي بهينه شده مطابقت داشت. تعداد كدون‌هاي نادر با فراواني كم‌تر از 10% قبل از بهينه‌سازي 41 عدد بود كه پس از بهينه‌سازي هيچ كدوني با فراواني كم‌تر از 10% يافت نشد. به منظور انتقال ژن كيموزين A به وكتور بياني pPIC9 مخمري، ژن سنتز شده كيموزين با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي تكثير و در وكتور PTG-19 همسانه‌سازي گرديد. كلونيهاي نوتركيب از طريق روش غربالگري كلوني‌هاي سفيد-آبي گزينش شدند. ژن كيموزين با استفاده از آنزيم‌هاي Not I و EcoR I از وكتور PTG19-chymA برش داده شده و در وكتور pPIC9 برش يافته با همان آنزيم‌ها همسانه گرديد. كلوني‌هاي نوتركيب pPIC9-chymA با استفاده از تكنيك كلوني ‌PCR شناسايي و انتخاب شدند. ماهيت نوتركيبي و درج صحيح ژن كيموزين در وكتور بياني مخمري pPIC9 از طريق استخراج پلاسميد و برش با آنزيم برشي BamH I مورد تاييد قرار گرفت.

Animal chymosin due to the high quality of cheese texture and flavor is the most effective enzyme for cheese production. Due to the increasing demand for this enzyme, in addition to the plant and microbial sources, recombinant sources should be considered for chymosin production. In this study, in order to produce recombinant chymosin, as well as improving the expression of bovine chymosin gene in yeast, the sequence of the chymosin A gene was optimized and synthesized based on the codon usage of the Pichia pastoris and was cloned in an appropriate expression vector. The codon adaptation index (CAI) increased from 0.59 to 0.72 after codon optimization. There were 41 yeast rare codons (with frequency of less than 10%) in the bovine chymosin A gene, whereas no rare codons in the codon optimized sequence. In order to transfer the resynthesized chymosin A gene to the yeast expression vector pPIC9, this gene was proliferated using the specific primers and was cloned in the PTG-19 vector. Recombinant (PTG19-chymA) colonies were selected by the screening of white-blue colonies method. The resynthesized chymosin A gene was then cut from PTG19-chymA vector using the restriction enzymes Not I and EcoR I, cloned into the pPIC9 vector and was transformed into DH5α strain of E. coli. Colonies containing recombinant vector (pPIC9-chymA) were identified and selected using colony-PCR technique. The recombinant nature and correct insertion of resynthesized chymosin A gene in the yeast expression vector pPIC9 were confirmed by plasmid extraction and its digestion with BamH I enzyme.