زيست پالايي هم زمان جيوه معدني و آلي با استفاده از وكتور نوتركيب pET28a(+)-merA-merB

Bioremediation of both mineral and organic mercury via the construction of recombinant vector pET28a(+)-merA-merB

سابقه و هدف: جيوه به دليل پايداري و هزينه زياد روش هاي متداول پالايش يك مشكل بزرگ زيست محيطي در جهان است. روش هاي زيستي مانند استفاده از بيوراكتورهاي مبتني بر باكتري ها يا آنزيم هاي آنها يكي از روش هاي زيست پالايي هستند. براي تجزيه تركيبات آلي و معدني جيوه از آنزيم هاي باكتريايي MerA و MerB استفاده مي شود. اين مطالعه با هدف همسانه سازي توام ژن هاي merA و merB در وكتور بياني pET28a (+) به منظور توليد آنزيم هاي فعال MerA و MerB طراحي گرديد. مواد و روش ها: ابتدا ژن هاي merA و merB از ژنوم باكتري هاي مقاوم به جيوه جداسازي و در داخل وكتور بياني pET28a(+) كلون گرديد. به منظور ارزيابي درستي همسانه سازي ژن مورد نظر، از روش PCR و هضم آنزيمي استفاده شد. وكتور نوتركيب pET28a(+)-merA-merB به دست آمده به درون باكتري اشريشيا كلي سويه BL21 منتقل شد. براي مشاهده افزايش مقاومت به جيوه معدني و جيوه آلي در باكتري تراريخته و عملكردي بودن آنزيم توليدي از وكتور نوتركيب، ميزان رشد باكتري هاي اشريشيا كلي سويه BL21 حاوي وكتور نوتركيب به همراه باكتري هاي اشريشيا كلي سويه BL21 بدون ژن هاي merA و merB در محيط حاوي جيوه معدني و جيوه آلي در مدت 48 ساعت اندازه گيري شدند. يافته ها: رشد باكتري اشريشيا كلي حاوي وكتور نوتركيب در محيط حاوي جيوه معدني و جيوه آلي در زمان ها و غلظت هاي مختلف جيوه اندازه گيري و نتايج نشان داد كه رشد باكتري هاي اشريشيا كلي حاوي وكتور بدون ژن هدف تا 12 ساعت پس از افزودن جيوه به شدت در تاثير محيط حاوي جيوه قرار گرفته و قادر به رشد در مقادير 10 و ppm 20 جيوه نمي باشند. اما باكتري هاي حاوي وكتور نوتركيب pET21a(+)-merA-merB در محيط حاوي جيوه رشد مناسبي داشتند. SDS-PAGE پروتئين هاي باكتري حاوي وكتور نوتركيب روي ژل آكريل آميد نشان داد كه پس از 16 ساعت القا با IPTG 1mM در دماي 37 درجه سليسيوس بيشترين بيان پروتئين هاي MerA (شصت و دو كيلودالتون) و MerB (بيست و سه كيلودالتون) مشاهده مي شود. نتيجه گيري: نتايج حاصل از توانايي رشد باكتري هاي اشريشيا كلي حاوي وكتور نوتركيب، عملكرد پروتئين هاي MerA و MerB در باكتري هاي ترار ريزش شده را نشان داد. همچنين افزايش مقاومت باكتري نوتركيب به جيوه معدني و جيوه آلي موجود در محيط بيانگر اين مساله است كه مي توان آلاينده هاي فلزات سنگين در محيط زيست را با مديريت مناسب از راه ساخت وكتور نوتركيب پاكسازي نمود.

Background & Objectives: Mercury due to stability and the high cost of conventional refinement methods is a major environmental problem in the world. Biological methods such as the use of bacterial-based bio-reactors or their enzymes are one of the bioremediation methods. MerA and MerB bacterial enzymes are used to decompose organic and inorganic compounds of mercury. This study was designed to clone merA and merB genes into the pET28a (+) expression vector for the production of MerA and MerB active enzymes. Material & Methods: At first merA and merB genes were isolated from mercury- resistant bacterial genome and subsequently cloned into pET28a(+) expression vector. Confirmation of cloning the target gene was achieved by PCR and restriction enzymes. Then pET28a(+)-merA-merB recombinant vector was transformed into E.coli strain BL21. To assess resistance to inorganic and organic mercury by transformed bacteria and the functionality of the enzyme produced by a recombinant vector, the growth of E.coli strain BL21 containing the recombinant vector and without it were measured by adding mercury into the environment during 48 h. Results: Recombinant bacterial growth in medium containing different levels of inorganic and organic mercury was measured at different times. The result showed that the growth of E. coli containing no target gene in the vector was affected after introducing mercury into the medium till 12 hours so that bacteria would not be able to grow at 10 and 20ppm mercury concentrations. However, transformed bacteria with pET28a(+)-merA-merB vector showed suitable growth in a mercury-containing medium. The SDS-PAGE analysis of extracted proteins from transformed bacteria with pET28a(+)-merA-merB vector on 12.5% acrylamide gel showed the highest MerA (62kDa) and MerB enzymes (23kDa) expression following 16 hours induction with 1mM IPTG at 37ºC. Conclusion: Growth ability of transformed E.coli with recombinant vector indicates MerA and MerB proteins function in transformed bacteria. Furthermore, increasing resistance of recombinant bacteria to inorganic and organic mercury indicates that heavy metal pollution in the environment can be cleaned up with proper management through the construction of a recombinant vector.