معرفي روش مولكولي PCR آشيانه اي (Nested RT-PCR) اصلاح شده جديد جهت تشخيص سريع بيماري نكروز عصبي ويروسي (Viral Nervous Necrosis)

The introduce of a new modified Nested RT-PCR molecular technique for rapid diagnosis of Viral Nervous Necrosis (VNN)

بيماري نكروز عصبي ويروسي، يكي از مهمترين بيماري‌‌هاي ويروسي با گسترش جهاني در ماهيان دريايي و پرورشي دنيا محسوب مي‌‌شود و تا به امروز بيش از 70 گونه حساس ماهي به اين بيماري شناسايي شده است. هدف از اين پژوهش رديابي و شناسايي سريع ويروس مذكور با استفاده از روش Nested RT-PCR از بافت مغز كفال ماهيان درياي خزر بود. در طول فصل صيد در سال 1395 تعداد 40 قطعه كفال طلايي (Liza aurata) در محدوده وزني 50 تا 250 گرم با علائم مزمن بيماري از سواحل درياي خزر جمع آوري شدند و پس از جداسازي بافت مغز و استخراج RNA ويروس، با استفاده از روش ترانس كريپتاز معكوس، سنتز cDNA از روي RNA ژنوم ويروس صورت گرفت. سپس با روش Nested RT-PCR و با استفاده از دو جفت آغازگر اختصاصي F2/R3 و NF2/NR3 طي دو مرحله، قطعه مورد نظر تكثير و توالي يابي شد. پس از بهينه سازي شرايط، واكنش PCR با استفاده از نمونه‌‌ي كنترل مثبت، در PCR مرحله ي اول (RT-PCR) در هيچ يك از نمونه‌‌هاي مشكوك كفال ماهيان باند مورد نظر مشاهده نشد. اما در دور دوم PCR (Nested RT-PCR ) در 20 مورد از 40 نمونه كفال ماهيان يك باند واضح bp 300 مشاهده شد. براساس نتايج بنظر مي‌‌رسد كه Nested RT-PCR مي‌‌تواند به عنوان روشي مناسب براي تشخيص سريع سطوح پايين آلودگي و همچنين يك روش مناسب و كاربردي براي شناسايي ماهيان حامل آلوده و به ظاهر سالم در نظر گرفته شود. همچنين نتايج حاصل از توالي يابي نشان داد كه ويروس مورد نظر در كفال ماهيان درياي خزر، متعلق به ژنوتيپ RGNNV مي‌باشد.

Viral Nervous Necrosis (VNN) is considered as one of the most important threats for mariculture and aquaculture in the world and up to now, it has been affecting more than 70 fish species. This study was aimed to detect and identify fish betanodavirus, the causative agent of VNN, using nested RT-PCR from brain tissue of Caspian Sea Mullet. Forty samples of subclinical golden grey mullet fish (range: 50-250 gr) were collected from the coastal areas of Caspian Sea in 2016. The target organ (brain) was excised and the reverse transcription (cDNA synthesis) was carried out followed by the RNA extraction. In the present study, detecting of the virus was performed with Nested RT-PCR using two pairs of primers F2/R3 and NF2/NR3 in two steps. After optimization of PCR, all of the forty specimens were negative by the first-step PCR (RT-PCR) while 20 out of 40 grey mullet were positive using Nested RT-PCR (second-step PCR) and a strong band of the expected size (300 bp) was clearly observed. Therefore, it seems that Nested RT-PCR is a method of choice for rapid detection of the low level of infection and in asymptomatic carrier fish. In addition, the result of sequencing revealed that the virus belonged to the RGNNV genotype.