ايجاد توتون تراريخت توليدكننده لاكاز قارچي با استفاده از يك پروموتر داراي بيان ريشه - ويژه

Generation of fungal laccase producing transgenic tobacco plants using a root-specific expression promoter

لاكازها گروهي از گليكوپروتئينها با ويژگي پلي فنلاكسيدازي هستند كه مي‌توانند تركيبات گوناگوني را اكسيد نمايند. اين گروه آنزيمي در گياهان، قارچ‌ها، حشرات و باكتري‌ها بيان مي‌شوند و داراي نقش‌هاي مهمي در فعاليت‌هاي زيستي و كاربردهاي گوناگوني در صنايع غذايي، دارويي، نساجي و حتي نظامي مي‌باشند. با توجه به ساختار اين آنزيم و اين‌كه تشكيلات بيان پروتئين در گياهان قادر به توليد كامل پروتئين‌ها ازجمله گليكوپروتئينها مي‌باشند به جهت كاربرد در پالايش زيستي، سازه‌اي طراحي گرديد كه لاكاز II قارچي تحت كنترل پيشرانه باكتريايي ويژه بيان در ريشه مانوپين سنتاز و تشديدكننده ترجمه Tobacco Etch Virus در گياه توتون بيان شود. افزودن سيگنال پپتيد اندوكيتيناز اسيدي Q توتون به ابتداي آنزيم باعث ترشح آن به فضاي آپوپلاستي مي‌شود. با استفاده از واكنش زنجيره‌اي پليمراز، تراريختي گياهان توتون توسط ژن لاكاز به‌وسيله آگروباكتريوم تأييد گرديد. نتايج نيمهكمي بيان ترانسكريپتوميك لاكاز در ريشه و برگ تراريختهاي مفروض نشانگر بيان متمايز آن در ريشه و برگ بود كه ناشي از كاركرد متمايز پيشرانه باكتريايي مانوپين سنتاز مي‌باشد. نتيجه وسترن بلاتينگ توليد پروتئين بالغ در ريشه را تأييد كرد. وجود اين پروتئين به‌صورت تك سايز نشانه عملكرد صحيح سيگنال پپتيد و ترشح آن به فضاي آپوپلاستي در ريشه توتون مي‌باشد. با توجه به كاربرد اين گياهان جهت استخراج آنزيم يا پالايش زيستي مي‌توان تراريخته اي موردنظر را بر اساس ميزان پروتئين و فعاليت آنزيمي غربالگري و گزينش نمود.

Laccases are a group of glycoproteins which can oxidize a wide range of compounds with various biological activities and industrial applications in food and beverage, pharmaceutical, textile, and even military-related industries. Regarding this enzyme structure and the ability of plant protein production machinery for protein glycosylation, a construct consisting of fungal laccaseII under control of root-specific mannopine synthase promoter and tobacco etch virus translation enhancer was designed for tobacco transformation to be used in phytoremediation. N-terminal addition of acidic tobacco endochitinase Q to Laccase directs its apoplastic secretion. Putative laccase agrobacterium-mediated transformants were confirmed using polymerase chain reaction. Semi-quantitative PCR of roots and leaves of putative transformants showed differential expression of the laccase gene at the transcriptomic level resulting from the differential function of bacterial mannopine synthase promoter. Western blotting results confirmed production of mature protein in roots which also confirms the correct function of signal peptide and secretion of this enzyme into the apoplastic space of roots. Regarding their application for protein production or phytoremediation transgenics of interest should be screened based on protein concentration and enzyme activity.