بررسي تأثير عامل‌هاي مؤثر در ميزان تشكيل پروتوپلاست در قارچ Fusarium oxysporum با هدف استفاده در امتزاج پروتوپلاست

Analysis of the effect of effective factors in protoplast preparation of Fusarium oxysporum for using in protoplast fusion

امتزاج پروتوپلاست يكي از سيستم­هاي تراريختي مؤثر در ايجاد تغييرهاي ژنتيكي به منظور بهبود عملكرد ميكروارگانيسم (ريزجانداران) است كه امروزه در جهت رسيدن به يك عامل بيوكنترل (مهار زيستي) موفق در كنترل علف هرزهاي مختلف استفاده مي­شود. در روش­هاي معمول تراريختي قارچ­هاي رشته­ اي مانند گونه‌هاي فوزاريوم، تهيۀ پروتوپلاست نخستين گام است. در اين پژوهش، پس از جداسازي قارچ Fusarium oxysporum (عامل پژمردگي آوندي) از گياه‌ گل جاليز Orobanche sp.، بررسي‌هاي لازم براي شناسايي ريخت‌شناسي و مولكولي آن انجام شد. سپس تأثير عامل‌هاي مختلف مانند تأثير نوع محيط كشت در مقدار اسپور توليد شده، بهترين زمان براي جوانه­ زني بيشينه‌اي اسپورها، غلظت­ هاي مختلف آنزيم­هاي تجزيه‌كنندۀ ديوارۀ سلولي، زمان در معرض قرارگيري با آنزيم در تعداد پروتوپلاست­ هاي توليد شده و نيز نوع و غلظت تثبيت‌كنندۀ اسمزي در ايجاد و ميزان زنده­ماني پروتوپلاست‌ها ارزيابي شد. نتايج به‌دست‌آمده از تجزيۀ آماري داده­ ها، محيط Spezieller Nährstoffarmer Agar بهترين محيط كشت و زمان 16 ساعت را بهترين زمان براي ايجاد و جوانه ­زني اسپورها معرفي كرد. همچنين تركيب آنزيمي (Glucanex (15 Mm و (Driselase (20 Mm در زمان پنج ساعت با فاصلۀ معني ­داري از ديگر تيمارها بيشترين پروتوپلاست را توليد كرده و تثبيت‌كنندۀ (KCl 0/6 مولار) نيز به عنوان بهترين تثبيت‌كننده معرفي شد.

Protoplast fusion as a transgenic system is an effective technique improving microorganism performances by making genetic changes. Today, exploitation of this technique has been beneficial in biocontrol of weeds. For filamentous fungi such as Fusarium species, protoplast preparation is the first step in the common genetic transformation process. For this objective, the Fusarium oxysporum isolates were isolated from Bromrape (Orobanche sp.) and were identified by morphological and molecular characteristics. Thereafter, the effects of various factors including medium and incubation time in spore preparation were evaluated. Furthermore, the effect of some factors on protoplast preparation and longevity including enzyme concentrations, type and concentration of osmotic stabilizers and lytic incubation times were also assessed. The results of this study demonstrated that Spezieller Nährstoffarmer Agar was the best medium to prepare spores and the best incubation time for spore germination was 16 hours. In addition, concentrations of 15mM for Glucanex and 20mM for Driselase and 5 hours incubation time were the best lytic enzyme complex and incubation time period, respectively. The KCl at the concentration of 0.6M was the best osmotic stabilizer in protoplast preparation and longevity.