شناسايي، جداسازي و بررسي خصوصيات خانواده ژني ديفنسين در گياه عدس (Lens culinaris L.)

Identification, isolation and characterization of defensin gene family in lentil (Lens culinaris L

ديفنسين هاي گياهي، خانواده اي از پپتيدهاي ضد ميكروبي كاتيوني غني از سيستئين هستند. اين پپتيدها مولكول هايي كوچك با وزن مولكولي 5 تا 7 كيلودالتون هستند كه داراي هشت اسيد آمينه سيستئين محافظت شده بوده كه در ايجاد پل هاي دي سولفيدي نقش دارند. در مطالعه حاضر با استفاده از ابزارهاي بيوانفورماتيكي، خانواده ژني ديفنسين از گياه عدس جداسازي و تعيين خصوصيت شد. به اين منظور تمام توالي هاي نوكلئوتيدي مربوط به ژن هاي ديفنسين گياهان دو لپه اي (583 توالي) از بانك ژن دريافت شد. توالي هاي دريافت شده، عليه كتابخانه EST گياه عدس (9539 مورد EST) همرديف و نتايج حاصل با هم مخلوط و سر هم بندي شدند. قطعات سرهم بندي شده (كانتيگ ها) و قطعات غير سر هم بندي شده (سينگلتون ها) با استفاده از BLASTn، عليه پايگاه داده nr همرديف شدند. كانتيگ ها و سينگلتون هاي حاصل، براي وجود چارچوب خوانش باز كامل، دمين هاي عملكردي، سيگنال پپتيد، محل تجمع سلولي، خصوصيات فيزيكوشيميايي، فراواني اسيدهاي آمينه، فعاليت ضد ميكروبي و الگوي بيان مورد بررسي بيشتر قرار گرفتند. در نهايت با استفاده از واكنش PCR توالي كد كننده كامل ديفنسين ها تكثير و به صورت آزمايشگاهي تاييد شد. نتايج، وجود 6 كانتيگ كه حاوي چارچوب هاي خوانش باز به طول 222 تا 228 جفت باز بودند را مشخص كرد. توالي پروتئيني ديفنسين هاي شناسايي شده، حاوي دمين عملكردي Knot1 (Gamma-thionin) بود. اين ديفنسين ها داراي سيگنال پپتيد بودند و تجمع خارج سلولي داشتند. به علت فراواني بالاي اسيدهاي آمينه آبگريز، ديفنسين هاي شناسايي شده آبگريز بوده و ساختارهاي ثانويه پيچيده اي توليد مي كردند. نتايج آناليز ضد ميكروبي in silico، فعاليت ضد ميكروبي بالا را در ديفنسين هاي جداسازي شده نشان داد. آناليز بيان ژن in silico، الگوي متفاوتي از بيان را براي ديفنسين ها نشان داد. شناسايي توالي كد كننده ژن هاي ضد ميكروبي و بررسي خصوصيات آن ها اولين قدم در مهندسي ژنتيك است. در اين پژوهش براي اولين بار، توالي كد كننده كامل 6 ژن از ژن هاي خانواده ديفنسين از گياه عدس جداسازي شد و ساختار و ويژگي ها و الگوي بياني آن ها مشخص شد.

Plant defensins are a family of cysteine-rich cationic antimicrobial peptides. They are small molecules with molecular mass between 5 and 7kD and eight conserved cysteines that are involved in disulfide bond formation. In the present study, using bioinformatics tools, the defensin gene family were isolated and characterized from lentil. All nucleotide sequences of the defensin genes of dicotyledon plants (583 sequences) were retrieved from GenBank. The retrieved sequences were aligned against lentil EST library (9539 ESTs) and the resulted sequences were pooled and assembled. By using BLASTn tool, the assembled (contigs) and non-assembled (singletons) fragments were aligned against GenBank nr database. The resulted contigs and singletons were further analyzed for presence of complete ORFs, functional domains, signal peptides, subcellular localization, physicochemical properties, amino acid frequency, antimicrobial activity and expression pattern. Finally, by using PCR, complete coding sequence of defensins were amplified and experimentally validated. The results determined the existence of 6 contigs that contained ORFs of 222 to 228 bp. The protein sequences of identified defensins contained Knot1 (Gamma-thionin) functional domain. These defensins had signal peptides and extracellular localization. Due to high frequency of hydrophobic amino acids, the identified defensins were hydrophobic and produced complex secondary structures. The results of antimicrobial analysis showed high antimicrobial activity in the identified defensins. The gene expression analysis, showed a different pattern of expression for defensins. The identification and characterization of antimicrobial genes is the first step in genetic engineering. For first time in this study, full length coding sequence of defensin gene family was isolated from lentil and structures, features and expression pattern of them were determined.