تشخيص مشاهده اي ويروس X سيب زميني در آزمون IC-RT-LAMP با استفاده از رنگ HNB

Visual detection of Potato Virus X in IC-RT-LAMP assay by using HNB dye

سيب زميني به وسيله ويروس هاي مختلفي آلوده مي شود كه مي توانند عملكرد را كاهش دهند، ويروس X سيب زميني (PVX) به لحاظ اقتصادي يكي از ويروس هاي مهم اين محصول است. روش هاي متعددي شامل آزمون هاي سرولوژيكي و مولكولي جهت تشخيص اين ويروس وجود دارند، اما اين روش ها زمان بر بوده و نيازمند ابزارهاي پيچيده اي هستند. هدف از اين پژوهش، كاهش زمان مورد نياز جهت تشخيص PVX با استفاده از روش IC-RT-LAMP بود. نمونه هاي برگي (50 نمونه) با علايم مشابه به ويروس X سيب زميني از سطح استان كردستان جمع آوري و براي آزمون سرولوژيكي (DAS-ELISA) به كارگرفته شدند. واكنش IC-RT-LAMP به صورت يك مرحله اي (بدون نياز به استخراج RNA) ، تحت شرايط هم دما انجام شد و نتايج به وسيله الكتروفورز بر روي ژل آگارز و رنگ هيدروكسي نفتول بلو (HNB) ارزيابي شد. نتيجه مثبت استفاده از رنگ HNB تغيير رنگ مخلوط واكنش از بنفش به آبي آسماني بود. از مزاياي روش IC-RT-LAMP در مقايسه با ساير روش هاي پيشين مي توان به اختصاصيت بالا، حساسيت بالا، سرعت بالا، كارآيي بالا، ايمني، سهولت، عدم نياز به تجهيزات پر هزينه جهت تكثير، عدم نياز به استخراج RNA، عدم نياز به كارهاي تشخيصي بعد از تكثير، تشخيص مشاهده اي و كاربر دوستي آن اشاره كرد.

Potato can be contaminated by many different viruses that can reduce yield . Potato virus X (PVX) is one of the most economically important viruses of this product. There are several techniques to detect PVX including serological and molecular assays but these methods are time consuming and requiring using complicated tools. The aim of this study was to reduce the time required to detect PVX, using IC-RT-LAMP technique. Fifty leaf samples with symptoms similar to PVX were collected from Kurdestan province and were subjected to a serological (DAS-ELISA) test. One-step IC-RT-LAMP reaction was carried out under isothermal conditions (without RNA extraction) and results were evaluated by agarose gel electrophoresis and hydroxynaphthol blue (HNB) dye. A positive result using the HNB dye was a color change in master-mix from the violet to sky blue. The advantages of IC-RT-LAMP method in compare to other methods are the high specificity, high sensitivity, high rapidity, high efficiency, safety, high efficiency, no expensive tools for amplification, no RNA extraction, no post-amplification treatment of the amplicons, visual detection and user friendly.