همسانه سازي، بهينه سازي شرايط بيان و تخليص پروتئين نوتركيب Nef-MPER-V3 ويروس HIV-1 در سيستم بياني پروكاريوتي

Cloning, Optimization of Expression Condition and Purification of the Recombinant Nef- MPER-V3 Protein of HIV-1 in Prokaryotic Expression System

مقدمه: پروتئين تنظيمي Nef و همچنين پروتئين هاي ساختاري MPER و V3 ويروسHIV از اهداف مهم در مطالعات واكسن بشمار مي روند. لذا در مطالعه حاضر، پروتئين فيوژن Nef-MPER-V3 در سيستم بياني پروكاريوتي كلون، بيان شد تا به عنوان كانديد مناسب در مطالعات آتي واكسن مورد ارزيابي قرار گيرد. روش كار: توالي ژن Nef-MPER-V3 سنتز و توسط آنزيم هاي NotI /HindIII به داخل وكتور pET-28a كلون شد. سپس، بيان پروتئين نوتركيب در سيستم بياني BL21(DE3) انجام شد. به منظور بهينه سازي بيان، فاكتورهايي نظير زمان القاء، غلظت IPTG و دانسيته نوري (OD) مورد ارزيابي قرار گرفت. پروتئ ميزان بيان توسط الكتروفورز SDS-PAGE تعيين گرديد. سپس، پروتئين با استفاده از ستون Ni-NTA agarose تخليص شد و نهايتا، توسط وسترن بلات تعيين هويت و تاييد شد. يافته ها: ژن هدف با موفقيت در وكتور بياني كلون و پس از انتخاب بهترين شرايط بيان شامل: غلظت 2 ميلي مولار IPTG دركدورت نوري7/0OD600nm= و بمدت پنج ساعت پس از القاء، پروتئين بيان شده بوسيله كروماتوگرافي تمايلي تحت شرايط دناتوره و با استفاده از اوره با غلظت حدود 300 ميكروگرم در ميلي ليتر تخليص شد. پروتئين فيوژن تخليص شده بصورت يك باند واضح حدود 35 كيلودالتون در SDS-PAGE مشاهده شد و با استفاده از آنتي بادي ضد Nef در وسترن بلات آشكار شد. نتيجه گيري: نتايج ما نشان داد كه پروتئين نوتركيب NEF-MPER-V3 در سيستم بياني BL21 (DE3) بخوبي بيان شده و پروتئين تخليص شده قابليت استفاده در آزمايشات آتي به منظور ارزيابي ايمنوژنسيتي آن در موش كه در حال انجام مي باشد را دارد.

Abstract: (276 Views) Background: Nef regulatory protein as well as structural proteins MPER and V3 of HIV-1 is important targets in vaccine studies. Therefore, in the current study, the Nef-MPER-V3 fusion protein was cloned and expressed in prokaryotic expression system that will be considered as a candidate for future vaccine studies. Materials and Methods: The Nef-MPER-V3 sequence was synthesized and inserted into pET-28a(+) vector using NotI/HindIII enzymes. Then, the recombinant construct was expressed in BL21 (DE3) strain of E.coli. Several factors including time course, IPTG concentration and optical density (OD) were evaluated for optimization of protein expression. The protein expression was purified on a Ni-NTA agarose column and analyzed by 12% SDS-PAGE. Finally, the fusion protein was identified and confirmed by western blotting. Results: The target gene was cloned successfully into the recombinant vector and after selection of the best condition for the protein expression such as; 2 mM of IPTG, OD= 0.7 at 600nm and 5 hours after induction, purification of the recombinant protein by affinity chromatography in denaturing condition by urea yielded about 300 µg/ mL. The purified fusion protein migrated as a clear band of around 35 kDa in SDS-PAGE and was detectable using anti-Nef antibody in western blotting. Conclusion: Our results showed that the Nef-MPER-V3 protein was successfully expressed in prokaryotic system and purified protein may provide the antigen for future experiments for immunogenicity evaluation in mice are currently undertaken.