طراحي، ساخت، بيان و تخليص ژن كدكننده پروتئين كايمر CfaE, CotD از باكتري Enterotoxigenic Escherichia coli

Design, Construction, Expression and Purification of the Gene Encoding Chimeric Cfae, Cotd Protein, from Enterotoxigenic Escherichia Coli

زمينه و هدف: اشرشياكلي انتروتوكسيژنيك (ETEC) يكي از رايج‌ترين علل باكتريايي مرگ و مير ناشي از اسهال در كودكان و مسافران كشورهاي در ‌حال توسعه مي‌باشد. فاكتورهاي كلونيزاسيون ETEC مانند CFA / I و CS2 نقش مهمي در ايجاد بيماري دارند. در اين مطالعه براي ساخت پروتئين نوتركيب از همجوش زيرواحد راسي CFA / I (CfaE) و زير واحد ساختاري CS2 (CotD) از ETEC استفاده شده است. از آن‌جايي كه پاسخ‌هاي ايمني مخاطي روده عليه CF‌‌‌ها مي‌تواند مانع از ايجاد بيماري شود، مطالعه حاضر با هدف توليد آنتي‌ژن كايمريك به جهت ساخت واكسن موثر عليه باكتري ETEC انجام شد. مواد و روش‌ها: به منظور تكثير ژن cfae-cotd، از ساختار ژني دوگانه متشكل از cfae و cotd، واكنش PCR توسط پرايمرهاي طراحي‌شده انجام شد. ژن تكثير شده در وكتور بياني pET28a همسانه‌سازي شد. در پي القاي سازه ژني نوتركيب با ماده‌ي IPTG، پروتئين نوتركيب بيان و با ستون كروماتوگرافي ميل تركيبي، خالص‌سازي و به وسيله وسترن بلاتينگ توسط Anti-Histag تاييد شد. ملاحظات اخلاقي: اين مطالعه با كد IR.IAU.SRB.REC.1397.066 در كميته اخلاق پژوهشي دانشگاه آزاد اسلامي واحد علوم و تحقيقات تهران به تصويب رسيده است. يافته‌ها: صحت همسانه سازي با استفاده از كلوني PCR و واكنش هضم آنزيمي تاييد شد. حضور باند در ژل SDS-PAGE 10% در محدوده‌ي 68 كيلو دالتوني، بيان پروتئين نوتركيب و هم‌چنين حضور باند بر كاغذ نيتروسلولز در محدوده مذكور در آزمون وسترن بلاتينگ، تاييدي بر توليد پروتئين نوتركيب بود. نتيجه‌گيري: بهينه سازي كدون و بيان در ميزبان‌‌‌هاي هترولوگ يك روش مفيد در توليد پروتئين‌هاي نوتركيب است. هم‌چنين توليد آنتي ژن‌‌هاي ETEC به عنوان كانديد واكسيناسيون بر عليه اين باكتري مطرح مي‌باشد.

Background and Aim: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is one of the most common bacterial causes of diarrhea deaths among children and travelers in developing countries. The ETEC colonization factors, such as CFA/I and CS2 play an important role in the development of the disease. In this study, to produce the CFaE fusion recombinant protein, the tip subunits CFA/I(CfaE) and sub structural unit of CS2 (CotD) from ETEC, were used. Since mucosal immune responses to CFs can prevent disease, the aim of this study was to develop a chimeric antigen for developing the effective vaccine. Materials and Methods: In order to amplify the cfae-cotd gene, a dual gene construct consisting of cfae and cotd, the PCR reaction was performed by designed primers. The propagated gene was cloned in the expression vector pET28a. Following the induction of a recombinant gene construct with IPTG, the recombinant protein was expressed and purified by Ni-NTA chromatography column and confirmed by western blotting by Anti-Histag. Ethical Considerations: This study with research ethics code IR.IAU.SRB.REC.1397.066 has been approved by research ethics committee at Islamic Azad University, Science and Research Branch of Tehran, Iran. Findings: Cloning accuracy was confirmed by PCR and enzyme digestion reaction. The presence of the band in the SDS-PAGE 10% gel in the 68 kDa region, the expression of the recombinant protein, and the presence of the band on the nitrocellulose paper in the Western blotting test confirmed the production of recombinant protein. Conclusion: Optimization of codon and expression in heterologous hosts is a useful method for the production of recombinant proteins. The production of ETEC antigens as a candidate for vaccination against this bacterium is also prominent.