راه اندازي روش Real-Time PCR جهت تعيين بار پرووايرال ويروس لنفوتروپيك T انساني نوع I به روش سايبرگرين جهت نمونه هاي اهداكنندگان خون

Design a Real Time PCR with SYBR Green for quantification of HTLV-1 proviral load for blood donors

سابقه و هدف استان خراسان در ايران براي ويروسHTLV-1 اندميك است. با توجه به ناكارآمد بودن آزمايش هاي سرولوژيكي در شناسايي ويروس ها در دوره كمون، تاييد جواب هاي نامشخص وسترن بلات و خطر انتقال ويروس HTLV-1 از راه خون و فرآورده هاي خوني، آزمايش Real - Time PCR به روش سايبرگرين راه اندازي شد. نمونه هاي مورد آزمايش، مربوط به اهداكنندگان خون آلوده به اين ويروس در پايگاه انتقال خون استان خراسان رضوي در سال 1396 بودند. مواد و روش ها در يك مطالعه تجربي، با استفاده از روش كلونينگ و رسم منحني استاندارد، آزمايش Real - Time PCR براي تعيين پرووايرال لود راه اندازي شد. ابتدا DNAژنومي از سلول هاي تك هسته اي خون محيطي استخراج شد. سپس محصول PCR ژن Tax ، در يك وكتور كلونينگ قرار داده شد و با رقت سازي، منحني استاندارد رسم و آزمايش Real - Time PCR با روش سايبرگرين راه اندازي شد. يافته ها با استفاده از محصول PCR براي ژن Tax، وكتور pTZ57/T و باكتريE.Coli (سوش TG1) كلونينگ انجام شد. صحت كلونينگ با Colony PCR و تعيين سكانس تاييد شد. محصول كلونينگ به عنوان استاندارد آزمايش Real -Time PCR استفاده شد و با رقت سازي، منحني استاندارد رسم شد. شيب خط منحني استاندارد 3/3 slope= و R2 = 0.99 بوده كه نشان دهنده خطي بودن و كارآيي واكنش آزمايش مي باشد. نتيجه گيري روش Real -Time PCR جهت تعيين پرووايرال لود ويروس HTLV-1 مناسب است.

Background and Objectives In Iran, Khorasan province is an endemic area for HTLV-1 virus. Considering the inability of serological tests to determine HTLV-1 in window period, their failure to confirm the indetermination results of western blot, and given the probability for HTLV-1 transfusion transmission, a SYBR green-based Real Time PCR was set to measure the HTLV-1 proviral load. Materials and Methods In this experimental study, using a cloning method and drawing a standard curve, the Real - Time PCR test was run to determine the HTLV-1 proviral load. At first, genomic DNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells. Then, the PCR product of the Tax gene was placed in a cloning vector and recombinant plasmid was diluted by drawing a standard curve and a real-time PCR test was conducted using SYBR Green method. Results Cloning was performed using PCR product for tax gene, pTZ57/T vector, and E. coli (TG1 strain). Cloning accuracy was confirmed with Colony PCR and sequencing and used as the Real-Time PCR test standard. The standard curve was drawn with serial dilutions of recombinant plasmid containing Tax-1 gene. The slope of the standard curve was 3.3 and R2 = 0.99 which indicates the linearity and efficiency of the test reaction. Conclusions Real - Time PCR method is an appropriate method to measure HTLV-1 proviral load.