بهينه‌سازي وكتور بياني pET جهت فيوژن‌كردن پروتئين نوتركيب و بيوپليمر پلي‌پپتيد شبه‌الاستين

Optimization of PET Expression Vector for Fusion of Recombinant Protein and Elastin-Like Polypeptide Biopolymer

زمينه و هدف تكنيك DNA نوتركيب، يك روش قدرتمند و مناسب براي توليد بيوپليمرهاي پروتئيني با اختصاصيت در توالي آمينواسيد و شيمي فضايي است. پلي‌پپتيد شبه‌الاستين بيوپليمري زيست‌سازگار، زيست‌تخريب‌پذير و غيرايمونولوژيك است كه در مطالعات گوناگون بيوتكنولوژي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. تگ ELP يك تكنيك ارزان، سريع و غيركروماتوگرافي براي تخليص پروتئين‌هاي هدف است. در اين مطالعه وكتور بياني pET-MOD جهت كنار هم قرارگيري توالي ژن‌هاي ELP و پروتئين نوتركيب هدف، به منظور توليد پروتئين فيوژن نوتركيب به همراه تگ ELP طراحي و ساخته شدند. مواد و روش ها ژن MOD پس از طراحي و سنتز در بين سايت برش XbaI و XhoI موجود در وكتور pET-32a (+) كلون، و به سلول‌هاي (E.coli-BL21(DE3 ترانسفرم شد. سپس، كلني‌ها بر اساس اندازه پلاسميد جداسازي و به وسيله برش توسط آنزيم‌هاي با اثر محدود، بررسي شد. تأييد نهايي كلني‌هاي نوتركيبب با استفاده از PCR و توالي‌يابي (DNA (DNA sequencing انجام گرفت. ملاحظات اخلاقي اين مطالعه در كميته اخلاق دانشگاه علوم پزشكي اراك با كد 11-146-92 تصويب شد. يافته ها جايگزيني توالي MOD در وكتور pET-32a (+) باعث حذف قطعات بيان‌كننده تگ‌هاي فيوژن (Thioredoxin:TRX Histidine:HIS ،S-tag)، سايت شناسايي هضم آنزيمي پروتئاز (TEV) و جايگاه كلونينگ چندگانه و اضافه‌كردن توالي‌هاي شناسايي آنزيم با اثر محدود اختصاصي ژن ELP و ژن هدف شد. درنتيجه در وكتور بهينه‌شده pET-MOD كاهش 466 نوكلئوتيد در سايز و بهبود ساختار ثانويه حاصل شد. نتيجه گيري با توجه به بهبود ساختار فضايي و كاهش اندازه وكتور pET-MOD، و نيز امكان فيوژن‌كردن پروتئين نوتركيب با تگ ELP‌، امكان استفاده اختصاصي از اين وكتور به منظور ELPyation پروتئين هدف وجود دارد.

Background and Aim recombinant DNA technique is a powerful and appropriate method for the production of protein biopolymers with specificity in amino acid sequence and spatial chemistry. Elastin-Like Polypeptide (ELP) is a biocompatible, biodegradable and non-immunological biopolymer used in various biotechnology studies. The ELP tag is a cheap, fast and non-chromatographic technique for purifying target proteins. In this study, pET expression vector was designed for the combination of ELP gene sequences and target recombinant protein in order to produce recombinant fusion protein with the ELP tag. Methods & Materials MOD gene was transformed to E. coli-BL21 (DE3) cells after designing and synthesis among the XbaI and XhoI restriction sites in the pET-32a (+) vector of the clone. Then, colonies were isolated based on plasmid size and examined by cutting using restriction enzymes. The final recombinant colonies was verified using polymerase chain reaction method and DNA sequencing. Ethical Considerations The Research Ethics Committee of Arak University of Medical Sciences approved all ethical considerations ofworking on laboratory animals (Code: 92-146-11). Results Replacing the MOD sequence in the pET-32a vector (+) eliminated the components expressing the fusion tags (Thioredoxin, Histidine, and S-tag), the identification site of protease enzyme (tobacco etch virus), and multiple cloning site. In addition, it added specific restriction enzyme identification sequences of ELP gene and target gene. As a result, in the optimized pET-MODvector, 466 nucleotides reduced in size and the secondary structure was improved. Conclusion Considering the improvement of spatial structure and reduction of pET-MOD vector size, as well as the possibility of the fusion of recombinant protein with the ELP tag, it is possible to use this vector for ELPyation of the target protein.