بهينه‌سازي كشت ريشه‌هاي مويين گياه دارويي هميشه بهار Calendula officinalis به منظور توليد تركيب دارويي اولئانوليك اسيد

Optimization of hairy root production in Calendula officinalis for production of oleanolic acid

گياه هميشه‌بهار (Calendula officinalis) گياهي دارويي با خاصيت ضدميكروب و ضد‌التهاب مي‌باشد. يكي از تركيبات دارويي مهم يافت شده در اين گياه، اولئانوليك اسيد است كه داراي اثرات ضدباكتريايي، ضدويروس و ضد تومور مي‌باشد. از ميان روش‌هاي مختلف كشت بافت گياهي، تكنيك كشت ريشه‌هاي مويين براي توليد و افزايش متابوليت‌هاي ثانويه دارويي مورد توجه قرار گرفته است. در آزمايش حاضر، ريزنمونه‌هاي برگ با پنج سويه اگروباكتريوم رايزوژنز (15834 و MSU و2656 و 1000R و 4A) در دو محيط كشت 1/2MS و 1/2B5 جهت القاي ريشه مويين، تلقيح شدند. ريشه‌هاي مويين در 4 نوع محيط كشت1/2B5 ، 1/4B5، 1/2MS و1/4MS به دو صورت مايع و جامد و همراه هورمون اكسين IAA با غلظت‌هاي 0، 5/0 و 1 ميلي‌گرم بر ليتر كشت شدند. سپس ميزان اولئانوليك اسيد در ريشه طبيعي، برگ، گلبرگ و ريشه‌هاي مويين تحت تيمار غلظت‌هاي صفر، 100 و 500 ميلي‌مولار محرك متيل جاسمونات، با روش HPLC اندازه‌گيري گرديد. بر اساس نتايج، بيشترين (43/4 درصد) و كمترين (69/13 درصد) ميزان توليد ريشه‌هاي مويين به ترتيب در سويه‌هاي MSU و 2656 حاصل شد. ميانگين توليد ريشه مويين در محيط كشت1/2B5 ، 84/35 درصد و در محيط كشت 1/2MS، 67/25 درصد بود. ريشه‌هاي مويين در محيط كشتB5 2/1 و در سطح هورموني يك ميلي‌گرم بر ليتر از IAA بيشترين رشد را داشتند. بيشترين مقدار اولئانوليك اسيد را ريشه‌ي طبيعي داشت (16 ميكروگرم در يك گرم وزن خشك). متيل جاسمونات در غلظت 500 ميلي‌مولار، مقدار اولئانوليك اسيد را در ريشه مويين افزايش داد اما در غلظت 100 ميلي‌مولار، باعث كاهش اين تركيب شد.

Calendula officinalis is a medicinal plant and widely used for its anti-inflammatory, antibacterial, antifungal and etc properties. Oleanolic acid is an important bioactive compounds which found in C.officinalis. Hairy root cultures are characterized by high growth rate and ability to synthesize secondary metabolites. Some factors are effective on the production of hairy roots. So this experiment was performed to select the best strain of Agrobacterium rhizogenes , culture medium and light condition for production of hairy roots. Highest (43/4%) and the lowest (13/69%) of hairy root production were obtained by MSU and 2656 strains respectively. The Average production of hairy roots in ½B5 culture medium, 35/84% and in ½ MS culture medium was 25/67%. So it seems that the ½ B5 medium is better culture medium. There was no significant difference between light and dark condition for production of hairy roots. The branches (6-7cm) from A1 clone of hairy roots were cultured in ½ B5, ¼ B5, ½ MS and ¼ MS culture media, in both liquid and solid media, and the branches were treated by three concentrations of auxin (IAA) (0, 5.0 and 1 mg/l). After two months, Hairy roots have highest growth in the ½ B5 culture medium with 1mg/l of IAA. The effect of three levels of methyl jasmonate elicitor (0, 500 and 100mM) on amount of oleanolic acid was investigated in normal roots and hairy roots and determined by HPLC. Methyl jasmonate at 500mM, increased oleanolic acid production but at 100mM concentration, this compound was reduced.