همسانه‌سازي ژن كراتيناز در اشرشياكلي و بررسي برخي از خصوصيات بيوانفورماتيكي آن

كراتيناز از آنزيم‌هاي پروتئوليتيك در طبيعت مي‌باشد. اين آنزيم تنها در حضور سوبستراي كراتين توليد مي‌شود و عمدتاً پيوندهاي دي‌سولفيدي را مورد هدف قرار مي‌دهد. در اين مطالعه از سويه باكترياييBacillus licheniformis كه قبلا از بستر مرغداري جدا شده بود، براي استخراج ژن كراتيناز استفاده شد. واكنش تكثير ژن كراتيناز با روش PCR با استفاده از DNA ژنومي استخراج شده از باكتري بومي انجام شد. پس از خالص‌سازي، ژن كراتيناز با روش همسانه‌سازي T/A به ناقل pTZ57R/T منتقل شد. پس از انجام واكنش اتصال بين محصول PCR و حامل pTZ57R/T، ترنسفورم محصولات لايگيشن به باكتري اشرشياكلي سويه DH5α صورت گرفت. انجام واكنش PCR با استفاده از آغازگرهاي F. B. 1 و R. B. 1 روي پلاسميد ker- pTZ57R/T، منجر به تكثير ژن كراتيناز به‌طول 1164 جفت‌باز شد كه داراي توالي‌ برش آنزيم‌هاي XhoI و NcoI براي انتقال مناسب به وكتور بياني (+)pET-26b بودند. استخراج پلاسميد نوتركيب از كلني‌هاي شناسايي شده صورت گرفت و به باكتري اشرشياكلي سويه BL21 انتقال داده شد كه رشد كلني‌هاي باكتريايي بر روي محيط LB آگار حاوي آنتي‌بيوتيك كانامايسين نشان از انتقال موفقيت‌آميز سازه ker-pET-26b(+) به اين سويه داشت. تعيين توالي نوكلئوتيدي ژن مورد نظر انجام شد. وزن مولكولي پس از ترجمه توالي نوكلئوتيدي به توالي پروتئيني معادل 39879.88 كيلو دالتون تخمين زده شد. بار خالص پروتئين معادل 0.009- با ضريب آليفاتيك 84.73 و داراي سيگنال پپتيدي مي‌باشد. اين آنزيم يك سرين پروتئاز با جايگاه‌هاي فعال اسيدآمينه آسپارتيك 137، هيستيدين 168 و اسيد آمينه سرين 325 مي‌باشد. به‌طوركلي نتايج مطالعات بيوانفورماتيكي نشان مي‌دهد كه آنزيم كراتيناز مورد مطالعه در دسته آنزيم‌هاي پايدار قرار مي‌گيرد كه قابليت استفاده در صنايع مختلف را دارا مي‌باشد