همسانه سازي و بيان ژن پروتئين پوششي جدايه‌ ايراني ويروس لكه برگي كلروتيك سيب (ACLSV) در E. coli

ويروس لكه ­برگي كلروتيك سيب (Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) يكي از ويروس­هاي مهم درختان ميوه دانه­ دار و هسته­ دار مي­باشد كه گسترش جهاني دارد. هدف از اين مطالعه، ساخت سازه بياني و سپس بيان ژن پروتئين پوششي (Coat Protein (CP)) ويروس لكه ­برگي كلروتيك سيب در باكتري Escherichia coli مي­باشد. بيان پروتئين پوششي در سيستم پروكاريوتي، نياز به خالص‌سازي ويروس از گياه ميزبان را كه مستلزم وجود اولتراسانتريفوژ است، مرتفع مي‌سازد. به منظور توليد پروتئين پوششي نوتركيب، جدايه SSa از ميزبان سيب جداسازي و با آغازگرهاي اختصاصيACLSV-MF وACLSV-MR ژن كامل پروتئين پوششي به طول 582 جفت باز تكثير شد. ژن كامل CP به حامل همسانه‌سازي pTG19 متصل‌ و به باكتري E. coli سويه DH5α منتقل شد. باكتري‌هاي تراريخت شده با پلاسميد نوتركيب روي محيط كشت LB حاوي آمپي‌سيلين، X-Gal و IPTG غربال و به روش تجزيه قليايي استخراج گرديدند. اين ژن در پلاسميد استخراج شده با آنزيم‌هاي BamHI و XhoIكه محل اثر آنها در آغازگرها قرار داده شده بودند، برش و به حامل بيان pET28a(+) كه با همين دو آنزيم برش داده شده بودند، اتصال داده شد. pET28a (+) حاوي ژن CP ويروس در باكتري E. coli سويه BL21(DE3) ترانسفورم و سپس القاء بيان CP با اضافه نمودن IPTG در غلظت نهايي 1mM پس از چهار ساعت در الكتروفورز در ژل پلي اكريل آميد حاوي سديم دودسيل سولفات (SDS-PAGE) بررسي شد. نتايج حاصل از SDS-PAGE حاكي از بيان پروتئين حدود 26 كيلودالتوني مربوط به ژن پروتئين پوششي ويروس مذكور بود. بيان اين پروتئين مي­تواند براي توليد آنتي­ بادي بر عليه ACLSV مورد استفاده قرار گيرد.