ارزيابي ميزان ايمني زايي آنتي ژن IpaD متصل شده به ليگاندهاي Co1 و STxB به صورت نازال بر عليه باكتري E. coli سويه O157:H7 در موش سوري

Immunogenic evaluation of nasal administration of conjugated IpaD with Co1 and STxB ligands against E.coli O157: H7 in mice

باكتري شيگلا، شايع ترين عامل اسهال بوده و تاكنون واكسن موثري عليه آن يافت نشده است. پروتئين IpaD و زير واحدB انتروتوكسين شيگلا (STxB) نقش مهمي در تهاجم، بيماري زايي و ايجاد عفونت توسط شيگلا دارد. از طرفي، ليگاند Co1 به عنوان يكي از سيستم هاي انتقالي آنتي ژن ها به سلول هاي M در لايه مخاطي، شناخته شده است. براي بررسي و مقايسه ميزان ايمني زايي هر يك از پروتئين هاي IpaD، IpaD-STxB و IpaD-Co1 از مدل حيواني موش سوري و روش نازال استفاده شد. توالي كد كننده اين پروتئين ها در ناقل pET28a كلون و به درون باكتري E.coli BL21 (DE3) منتقل شد. بيان پروتئين نوتركيب با استفاده از تكنيك لكه گذاري وسترن، مورد ارزيابي قرار گرفت. پروتئين نوتركيب با استفاده از ستون كروماتوگرافي جذبي تخليص و در چهار نوبت متوالي به موش سوري به صورت نازال داده شد. از نوبت دوم (يادآور اول) به بعد، يك هفته پس از دادن آنتي ژن، خون گيري انجام و سرم مورد آزمايش الايزا قرار گرفت. نتايج نشان داد كه ميزان توليد آنتي باديIgG عليه پروتئين IpaD-STxB بيش ترين و پروتئين IpaD-Co1 بعد از آن قرار داشت. چالش ايمني زايي اين پروتئين ها با استفاده از سم فعال باكتري E. coli سويه O157:H7 مورد ارزيابي قرار گرفت. نتايج نشان داد كه موش هاي ايمن شده توانستند در گام اول پنج برابر LD50 شيگا توكسين E. coli O157:H7 را تحمل نمايند؛ اما با تزريق 10 برابري LD50، پس از 24 ساعت موش هاي ايمن شده با IpaD و IpaD-Co1 و پس از 72 ساعت موش هاي ايمن شده با IpaD-STxB از بين رفتند. بر طبق نتايج مشخص شد كه پروتئين IpaD-STxB در قياس با فيوژن IpaD-Co1 قدرت ايمني زايي بيش تري در موش سوري نسبت به شيگا توكسين دارد.

The most common cause of diarrhea is Shigella and no vaccine has been found so far. IpaD and B subunit of Shiga toxin proteins (STxB) play an important role in invasion, infection and pathogenesis caused by Shigella. On the other hand, Co1 ligand has introduced as one of the antigen delivery systems to M-cells in mucosal layer. In this study, nasal administration of antigen in mice, used to evaluation and comparison of immunogenicity of IpaD, IpaD-STxB and IpaD-Co1 proteins. The coding sequences of proteins cloned in pET28a vector and transformed to bacterial strain of E.coli BL21(DE3). Recombinant protein expression confirmed by using of Western bloting technique. The each one of the recombinant protein purified by affinity chromatography column and used for nasal administration in four times consecutively on mice. After the second nasal administration (first booster), a week after each administration, blood samples were collected and ELISA performed on serum. The ELISA results of serum titration showed that the highest amount of IgG has been produced against IpaD-STxB protein; and IpaD-Co1 was in next step. The immunogenicity was evaluated using active toxin E. coli O157:H7. The challenge results showed that immunized mice could endure 5 times the LD50 Shiga toxin E. coli O157: H7; but after injection of 10 times the LD50, the immunized mice by IpaD, IpaD-Co1 and IpaD-STxB were death after 24, 24 and 72 hours, respectively. According to these results recombinant protein IpaD-STxB founded to be more immunogenic than IpaD-Co1 against shiga toxin in mice.