كلونينگ، بيان و تخليص اندونوكلئاز CEL I نوتركيب در رده سلولي HEK293T

Cloning, Expression, and Purification of Recombinant CEL I Endonuclease in HEK293T Cell Line

اندونوكلئاز CEL I، آنزيمي از خانواده S1 اندونوكلئازها است. اين آنزيم، با اختصاصيت بالا، توانايي شناسايي انواع جهش‌ها و جايگزيني بازها در مولكول DNA را دارد كه اين امر اهميت آن را در قالب محصولات تجاري به‌منظور مصارف تحقيقاتي و آزمايشگاه‌هاي باليني دوچندان مي‌كند. اگرچه اين آنزيم در گياه كرفس يافت مي‌شود اما به‌دليل زمان‌بربودن فرآيند استخراج و همچنين بازدهي كم محصول نهايي، استخراج آن مقرون‌به‌صرفه نيست. علاوه بر اين، با توجه به لزوم اعمال تغييرات پس از ترجمه براي دست‌يابي به ساختار فعال نهايي، تاكنون گزارشي مبني بر بيان فرم فعال اين آنزيم در ميزبان‌هاي باكتريايي مشاهده نشده است. بنابراين يكي از منابع توليد فرم فعال اين آنزيم، كلون و بيان آن در ميزبان‌هاي يوكاريوتي از جمله مخمر و رده‌هاي سلولي پستانداران است. در اين مطالعه، توالي ژن به‌منظور بيان در ميزبان يوكاريوتي HEK293T بهينه‌سازي و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزيم‌هاي KpnI و XhoI در وكتور بياني pBudCE4.1 ساب‌كلون شد. سازه بياني مورد نظر توسط ليپوفكتامين به رده سلولي HEK293T ترانسفكت و بيان پروتئين نوتركيب از طريق روش‌هاي متعددي از جمله SDS-PAGE، الايزا، واكنش نسخه‌برداري معكوس و وسترن‌بلات تاييد شد. آناليز داده‌هاي SDS-PAGE و وسترن‌بلات وزن مولكولي در حدود 30كيلو دالتون را تاييد كرد. تخليص با ستون حاوي رزين Ni-NTA انجام و مقدار پروتئين در حدود 0/2ميلي‌گرم بر ميلي‌ليتر تعيين غلظت شد. درنهايت فعاليت اندونوكلئازي آنزيم، روي DNA هترودوپلكس حاصل از محصول PCR ژن جهش‌يافته و وحشي بررسي شد. نتايج نشان داد كه بيان اين پروتئين در ميزبان HEK293T فعاليت مناسبي دارد.

CEL I endonuclease pertaining to the S1 endonuclease family. The enzyme, with its high specificity, has the ability to identify different types of mutations and base replacement in the DNA molecule, which makes it important in commercial products to use in research and clinical laboratories. Although the enzyme exists in the celery plant, the extraction of the enzyme is a time-consuming process and not economical and the yield of the final product is low. In addition, due to its post-translational modifications to achieve the final active structure, no report has published to indicate the expression of the active form of this enzyme in the bacterial hosts yet. Therefore, one of the production sources of the active form of this enzyme is its cloning and expression in eukaryotic hosts, including yeast and mammalian cell lines. In this study, in order to express CEL I endonuclease, its gene sequence was optimized and synthesized in host eukaryotic HEK293T. CEL I was subcloned by double digest with KpnI and XhoI enzymes in the pBudCE4.1expression vector. The expression construct was transfected into the HEK293T cell line by lipofectamine transfection. Expression of the recombinant protein after transfection into HEK293T cells was confirmed by multiple methods including polyacrylamide gel electrophoresis, ELISA, RT-PCR, and western blot reaction. The analysis of SDS-PAGE and western blot data confirmed the molecular weight of approximately 30kDa. Purification was carried out with the Ni-NTA column and the amount of purified protein was determined to be about 0.2mg/ml. Finally, the activity of endonuclease enzyme was investigated on both normal and mutated heteroduplex DNA amplified by PCR. The results showed that the expression of this protein in HEK293T host had shown sufficient activity.