سنجش بنسرآزيد به روش مهار فعاليت بيولمينسانسي اكورين

Determination of Benserazide Based on Bioluminescence Inhibition of Aequorin

اهداف: بدليل سهولت استفاده، غيرسمي بودن و قابليت بالاي فتوپروتئين اكورين در سيستم هاي رديابي، محققين توجه خاصي به استفاده از اين پروتئين بيولومينسانس داشته اند. هدف مطالعه حاضر طراحي روشي براي سنجش دقيق و آسان داروهاي مهم در پايش درماني از طريق روش مبتني بر مهار فعاليت بيولومينسانسي اكورين است. مواد و روش ها: در پژوهاهداف: به‌دليل سهولت استفاده، غيرسمي‌بودن و قابليت بالاي فتوپروتئين اكورين در سيستم‌هاي رديابي، محققين توجه خاصي به استفاده از اين پروتئين بيولومينسانس داشته‌اند. هدف مطالعه حاضر طراحي روشي براي سنجش دقيق و آسان داروهاي مهم در پايش درماني از طريق روش مبتني بر مهار فعاليت بيولومينسانسي اكورين است. مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربي حاضر تعدادي از داروهاي مهم در پايش دارويي و داراي شباهت ساختاري با كلنترازين، انتخاب و ميانكنش آنها با اكورين بررسي و شرايط سنجش واكنش بيولومينسانسي به‌منظور دستيابي به كمترين حد تشخيص بهينه‌سازي شد. يافته‌ها: از ميان داروهاي بررسي‌شده، تنها بنسرآزيد منجر به مهار فعاليت بيولمينسانسي اكورين شد كه اين اثر مهاري رفتار وابسته به غلظت داشت. بهترين نمودار دوز- پاسخ به دست آمد و IC50 26/0ميكرومولار محاسبه شد. دامنه خطي براي بنسرآزيد 100 تا 1500نانومولار و حد تشخيص و حد كمي‌سازي روش به‌ترتيب 79 و 260نانومولار به دست آمد. همچنين امكان استفاده از اين روش براي سنجش آناليت در نمونه سرم بررسي شد و نتايج ميزان بازيابي 97% را نشان داد. به‌منظور مشخص‌شدن مكانيزم مهار، نمودار دوز- پاسخ بنسرآزيد در حضور غلظت‌هاي مختلف كلنترازين رسم شد كه نشان داد IC50 تغيير مي‌يابد. نتيجه‌گيري: روش طراحي‌شده مي‌تواند براي سنجش بنسرآزيد استفاده شود و قابليت استفاده در نمونه سرم را دارد. همچنين نتايج نشان مي‌دهد بنسرآزيد با مهار رقابتي فعاليت بيولومينسانسي اكورين را مهار مي‌كند. ش تجربي حاضر تعدادي از داروهاي مهم در پايش دارويي و داراي شباهت ساختاري با كلنترازين، انتخاب و ميانكنش آن ها با اكورين بررسي شد و شرايط سنجش واكنش بيولومينسانسي جهت دستيابي به كمترين حد تشخيص بهينه سازي شد. يافته ها: از بين داروهاي بررسي شده، تنها بنسرآزيد منجر به مهار فعاليت بيولمينسانسي اكورين شد كه اين اثر مهاري رفتار وابسته به غلظت داشت. بهترين نمودار دوز-پاسخ بدست آمد و IC50 µM 26/0 محاسبه شد. دامنه خطي براي بنسرآزيد 100 تا 1500 نانومولار و حد تشخيص و حد كمي سازي روش به ترتيب 79 و 260 نانومولار بدست آمد. همچنين امكان استفاده از اين روش براي سنجش آناليت در نمونه سرم بررسي شد و نتايج ميزان بازيابي 97 درصد را نشان داد. به منظور مشخص شدن مكانيسم مهار، نمودار دوز-پاسخ بنسرآزيد در حضور غلظت هاي مختلف كلنترازين رسم شد كه نشان داد IC50 تغيير مي يابد. نتيجه گيري: روش طراحي شده مي تواند براي سنجش بنسرآزيد استفاده شود و قابليت استفاده در نمونه سرم را داراست. همچنين نتايج نشان مي دهد بنسرآزيد با مهار رقابتي فعاليت بيولومينسانسي اكورين را مهار مي كند.

Aims: Aequorin as a bioluminescence protein due to ease of use, non-toxic, and high capability of detecting has long been the interest of researchers. The aim of this study was to design a method for accurate and simple detection of important therapeutic agents using a bioluminescence inhibition based assay by using aequorin. Materials & Methods: In this study, important drugs in therapeutic monitoring with structural similarity to Coelenterazine, were selected and their interaction with aequorin was investigated. Further, the conditions of the bioluminescence assay were optimized to achieve the lowest detection limit. Findings: Among the drugs whose effects have been tested on aequorin, the only benserazide resulted in inhibition of the bioluminescence activity. This analyte can significantly reduce the bioluminescence of aequorin in a concentration-dependent manner. The best dose-response curve was obtained and IC50 of 0.26µM was calculated. The linear calibration curve was obtained in a range of about 100 to 1500nM with LOD and LOQ of 79 and 260nM, respectively. Furthermore, we demonstrated the application of the approach in human serum samples with a recovery of 97%. Guddem-Schild graph was plotted to determine the mechanism of inhibition which indicated that the IC50 of benserazide changed in the presence of different concentrations of Coelenterazine. Conclusion: The proposed method can be used for measuring benserazide which can easily be applicable for real samples. Also, the results show that benserazide inhibits the bioluminescence activity of aequorin by competitive inhibition.