استخراج و خالص‌سازي آنزيم تريپسين از روده ماهي سفيد (Rutilus frisii kutum) و محاسبه پارامترهاي سينتيك و نيمه عمر آن

Extraction and purification of Trypsin from intestine of Caspian kutum (Rutilus frisii Kutum) and Calculation of its Kinetic parameters and Half Life

در دهه‌هاي اخير بازيافت و شناسايي آنزيم هاي گوارشي از ماهيان توجه زيادي را به خود جلب كرده است و كاربردهاي جديدي نيز براي اين آنزيم ها در برخي از صنايع، از قبيل صنعت غذا و صنايع شوينده تعريف شده است. يكي از اين آنزيم‌هاي استخراجي تريپسين است كه در اين پژوهش با استفاده از روش سه مرحله‌اي استخراج با بافر Tris–HCl 50 ميلي مولار (حاوي 10 ميلي مولارCaCl2 با pH 5/7)، ترسيب با سولفات آمونيوم60% اشباع و كروماتوگرافي غربالي Sephadex G-75 از روده ماهي سفيد استخراج و خالص‌سازي شد و در نتيجه آن بازده 52% و ميزان تخليص 78/25 برابر (fold) بدست آمد. پارامترهاي سينتيكي Vmax و Km با استفاده از معادله ميكائيلس-منتن براي سوبستراي BAPNA بترتيب 9958/2 ميكرومول بر ميلي‌گرم در دقيقه و 5350/0 ميلي‌مول محاسبه گرديد و Kcat نيز S-1 2568/6 بدست آمد. نيمه عمر تريپسين روده ماهي سفيد نيز با استفاده از تبديل نمودار فعاليت آنزيم (دقيقه) به نمودار لگاريتم طبيعي و محاسبه شيب آن برابر با 72/58 دقيقه براي سوبستراي BAPNA محاسبه شد. نتايج نشان داد كه تريپسين روده ماهي سفيد با سهولت و هزينه كم قابل جداسازي و خالص‌سازي است و از لحاظ سينتيكي كارايي بالاتري نسبت به تريپسين تجاري (خوك) دارد و قابليت استفاده را در صنايع غذايي، صنايع شيلات، تهيه محيط كشت ميكروبي و همچنين كاربرد درتحقيقات بيوتكنولوژي دارد.

In recent decades, recovery and identification of digestive enzymes from fish has attracted much attention and new applications for these enzymes have been defined in some industries, such as the food and detergent industries. One of these recovered enzymes is Trypsin, which in this study was extracted and purified from the intestine of Caspian kutum using a three-step extraction method with 50 mM Tris-HCl buffer (containing 10 mM CaCl2 pH 7.5), 60% ammonium sulfate precipitation and Sephadex G-75 gel chromatography. The Result was an enzyme with 52% yield and a purity of 25.78-fold. The kinetic parameters of Vmax and Km for BAPNA substrate were calculated using the Michaelis-Menten equation and were 2.9958 µmol/mg.min and 0.5350 mM respectively and Kcat was 6.2568 S-1. The kutum Trypsin’s half-life was also calculated as 58.72 min for BAPNA substrate using the conversion of the enzyme activity graph (in minutes) to natural logarithmic graph and determining its slope. The results showed that it is easy and economical to extract and purify Trypsin from intestine of Caspian kutum and it is kinetically more effective than commercial Trypsin. It is suitable for use in the food industries, fish processing industry, culture media production as well as application in biotechnology research.