شناسايي مولكولي، بررسي تبارزايي و تنوع ژنتيكي ويروس موزاييك شلغم در مزارع كلزا استان خراسان جنوبي

Molecular characterization, phylogenetic analysis and nucleotide diversity of Turnip mosaic virus in canola fields of south Khorasan

كلزا با نام علمي (Brassica napus) يكي از اعضاي خانواده Brassicaceae(خردل يا خانواده كلم) با گل‌هاي زردرنگ مي‌باشد، كه عمدتا به دليل داشتن دانه‌هاي غني از روغن كشت مي‌شود. ويروس موزاييك شلغم (Turnip mosaic virus) از شايع‌ترين و مهم‌ترين بيماري‌هاي ويروسي كلزا در دنيا به‌شمار مي‌آيد. در فروردين و ارديبهشت‌ماه 1397، به‌منظور شناسايي مولكولي ويروس‌هاي جنس Potyvirus، تعداد 66 نمونه برگي از شهرستان‌هاي سرايان، فردوس، سه قلعه و آيسك در استان خراسان جنوبي جمع‌آوري شد. اين نمونه‌ها داراي علايم مشكوك ويروسي نظير زردي، كوتولگي، موزاييك، چروكيدگي برگي بودند. براي شناسايي ويروس، آر. ‌ان. ‌اي كل، با استفاده از كيت شركت دنازيست استخراج و دي. ‌ان. ‌اي مكمل از روي آر. ‌ان. ‌اي ويروسي ساخته شد. سپس با استفاده از يك جفت آغازگر دژنره مربوط به جنس پتي ويروس به نام CIR/CIF كه منطبق بر قسمتي از ناحيه ژن كدكننده پروتيين CI بود، قطعه‌اي به طول 680 جفت باز در 12 نمونه كلزا تكثير و تعيين توالي شد كه شباهت بالايي به ويروس موزاييك شلغم داشت. سپس اين نمونه‌ها، با آغازگر اختصاصي ژن پروتيين پوششي ويروس موزاييك شلغم (TuMVF/TuMVR)، آزمايش شدند، كه نهايتا منجر به تكثير قطعه اي به طول 980 جفت باز در هشت نمونه گرديد. نتايج تعيين توالي نشان داد كه هشت نمونه گياهي كلزا به ويروس TuMV آلوده مي‌باشند. در نهايت شش نمونه كه خوانش آنها به صورت كامل انجام شده بود، در بررسي‌هاي تبارزايي بر مبناي توالي پروتيين پوششي مورد استفاده قرار گرفت. بررسي‌هاي نوتركيبي نشان از وجود دو نمونه نوتركيب داشت كه از بررسي تبارزايي حذف شد. چهار جدايه‌ ايراني غير نوتركيب در گروه Asian BRو در مجاورت ساير جدايه‌هاي آسيا قرار گرفتند. تشابه توالي نوكليوتيدي در ناحيه پروتيين پوششي در بين گونه‌هاي اين تحقيق 95-90 درصد تعيين گرديد. بررسي‌هاي نوتركيبي نشان داد كه در دو جدايه ويروس موزاييك شلغم مطالعه‌شده در اين تحقيق به نام‌هاي CSe55 و CSe39 نوتركيبي محتمل است. همچنين بررسي‌هاي تنوع نوكليوتيدي جدايه‌ها بانرم افزار DnaSPو منفي بودن آزمون آماري Tajima’s D به اين معني است كه انتخاب در جهت متنوع شدن و بزرگ شدن جمعيت رخ داده است. تحقيق حاضر اولين گزارش از وقوع اين ويروس در مزارع كلزا استان خراسان جنوبي و اولين بررسي مولكولي و تبارزايي جدايه‌هاي ويروس مذكور در مزارع كلزا مي‌باشد.

Canola (Brassica napus) is one of the most important members of Brassicaceae family and Turnip mosaic virus is one of the most widespread viruses in canola fields all around the world. During May and April of 2018, 66 canola samples were collected from different regions of south Khorasan Province. The samples showed symptoms such as yellowing, stunning, mosaic and leaf distortion. Total RNA of samples was extracted by Dena Zist kit (Iran) and then DNA complementary was made by reverse primer. RT-PCR is done using specific primers of TuMV. A fragment with 680 bp length was amplified and sequenced in 12 canola samples that had high similarity to TuMV. Therefore, positive samples used in RT-PCR by specific primers of TuMV related to coat protein coding regions. Finally eight amplified fragments with 980 bp length were sequenced and then analyzed by Blast, MegaX, SDTv and DnaSPs softwares. Results showed that six samples of canola were infected by TuMV. Consequently, phylogenetic analysis of four non- recombinant isolates that are sequenced perfectly used in the phylogeny analysis and results showed that Iranian isolates in this study located in Asian BR phylogeny group included other Asian isolates. Nucleotide similarity between Iranian isolates ranged from 90 to 95%. Recombination analysis using RDP4 showed that two Iranian isolates (CSe55, CSe39) are recombinant and are evolved from minor and major parents. Nucleotide diversity by DnaSP showed that population of TuMV is developing in this part of Iran. This survey is the first report of TuMV in south khorasan and molecular investigation of TuMV in Canola field.